[发明专利]体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法

权利要求书

1.一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养得到肿瘤多细胞球体；所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白；

(2)先在激光共聚焦培养皿中均匀铺设一层I型鼠尾胶原，再向培养皿中加入I型鼠尾胶原与所述肿瘤多细胞球体的混合液；待凝固后，加入培养基、继续培养，所述待凝固为于(5±0.2)％的CO₂、(37±0.5)℃条件下放置25～35min，所述的培养基为含有8％-12％胎牛血清的培养基，所述培养为于(5±0.2)％的CO₂、(37±0.5)℃条件下培养；

(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长，至出现明显的集体侵袭细胞群时，使用激光共聚焦显微镜对所需区域的肿瘤细胞进行激光漂白荧光蛋白光转化，使所需区域的肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光；

(4)加入胶原酶消化、离心、重悬，制得细胞悬液；

(5)流式细胞仪分选以获得所需区域的肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述培养得到肿瘤多细胞球体的步骤包括：

向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒，利用超高速流式细胞分选系统分选出可进行光转换荧光肿瘤细胞；

采用悬滴培养法或微孔板培养法，将所述光转换荧光肿瘤细胞培养成肿瘤多细胞球体。

3.根据权利要求2所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述利用超高速流式细胞分选系统分选为：分选至少两次，每次间隔大于7天。

4.根据权利要求2所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，所述微孔板培养法为：计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液，将其加入96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板。

5.根据权利要求1-4任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长过程中，还包括利用激光共聚焦显微镜的时间序列拍摄方法，记录所述肿瘤多细胞球在I型鼠尾胶原内不同时间点伸展侵袭生长的形态。

6.根据权利要求1-4任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述激光漂白荧光蛋白光转化为：

选定所需转化的细胞，利用倒置激光共聚焦显微镜划定需要转化的范围；

使用波长为360～420nm或者460～500nm的激光进行荧光的连续激光漂白，至荧光蛋白的荧光颜色转变。

7.根据权利要求1-4任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，其特征在于，步骤(4)为所述制得细胞悬液为，加入胶原酶消化I型鼠尾胶原，于36.5～37.5℃，消化5～7min，800～1200rpm离心4～7min收集肿瘤细胞，以含2％胎牛血清的PBS重悬细胞。

8.一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法构建得到。