[发明专利]体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法

说明书

本发明提供了一种肿瘤3D集体侵袭模型及其构建方法，制备肿瘤多细胞类器官团，细胞中含有光转换荧光蛋白，将其包被于I型鼠尾胶中进行3D培养，体外模拟肿瘤细胞的生长状态、增殖方式和侵袭方式，该模型研究的是肿瘤多细胞球体类器官的集体侵袭作用，更能模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式，采用激光共聚焦显微镜进行光漂白后，可以在缺乏特异性生物学标记物的情况下对集体侵袭细胞中的Leader Cells与Follower Cells进行区分，并可通过荧光流式分选获得目的区域的肿瘤细胞进行后续实验研究。

技术领域

本发明涉及医药生物学领域，具体涉及一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型及其构建方法。

背景技术

传统的观察体外肿瘤细胞3D模型研究，一种是将单个肿瘤细胞包被入matrigelmatrix胶或者I型鼠尾胶原中进行培养及观察；另一种是将新鲜肿瘤组织标本剪碎处理后，把肿瘤组织小块包被入I型鼠尾胶原中进行培养及观察。

传统的单个肿瘤细胞体外3D生长模型能直观观察肿瘤细胞在胶内的生长增殖变化等，但无法观察细胞侵袭情况，难以模拟肿瘤细胞在体内集体侵袭方式；包被I型鼠尾胶原中的新鲜肿瘤组织块是多细胞组织块，虽可观察细胞侵袭生长，但组织块中除肿瘤细胞外还混有多种细胞成分(如血管内皮细胞、成纤维细胞、肌细胞等)，发生侵袭的细胞不能直接判定是否为肿瘤细胞，且难以获得目的区域的肿瘤细胞，尤其是在缺乏特异性生物学标记的情况下，难以对集体侵袭细胞中的Leader Cells和Follower Cells进行区分，不利于对于肿瘤侵袭的后续深入研究。

发明内容

基于此，针对上述问题，本发明的其中一个目的在于提供一种构建体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型，该模型能够模拟肿瘤细胞集体侵袭过程、且易分离得到目的区域肿瘤细胞进行后续研究。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种体外肿瘤细胞3D集体侵袭模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)培养得到肿瘤多细胞球体；所述肿瘤多细胞球体中的肿瘤细胞可表达光转换荧光蛋白；

(2)向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液；待凝固后，加入培养基、继续培养；

(3)所述肿瘤多细胞球体在I型鼠尾胶原内伸展侵袭生长，至出现明显的集体侵袭细胞群时，使用激光共聚焦显微镜对所需特定区域的肿瘤细胞进行漂白光转化，使肿瘤细胞中的光转换荧光蛋白由绿色荧光转换为红色荧光；

(4)加入胶原酶消化、离心、重悬，制得细胞悬液；

(5)流式细胞仪分选以获得所需特定区域的肿瘤细胞。

在其中一些实施例中，所述培养得到肿瘤多细胞球体，其步骤包括：

向肿瘤细胞中转染入可表达光转换荧光蛋白的质粒，利用超高速流式细胞分选系统分选出可进行光转换荧光肿瘤细胞；

采用悬滴培养法或微孔板培养法，将所述光转换荧光肿瘤细胞培养成肿瘤多细胞球体。

在其中一些实施例中，所述利用超高速流式细胞分选系统分选：分选至少两次，每次间隔大于7天。

在其中一些实施例中，所述微孔板培养法为：计数5000-10000个肿瘤细胞重悬液，将其加入96孔黑色圆底超低吸附球体培养微孔板。

在其中一些实施例中，所述步骤(2)为，先在激光共聚焦培养皿中均匀铺设一层I型鼠尾胶原，再向激光共聚焦培养皿中加入所述肿瘤多细胞球体与I型鼠尾胶原的混合液。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述待凝固为于(5±0.2)％的CO₂、(37±0.5)℃条件下放置25～35min；和/或

所述的培养基为含有8％-12％胎牛血清的培养基；和/或