[发明专利]一种快速测定生物被膜中大肠杆菌对抗生素耐药性的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种快速测定生物被膜中大肠杆菌对抗生素耐药性的方法，其步骤包括：生物被膜生长阶段；抗生素压力阶段；生物被膜恢复阶段。此方法利用微量接种针为载体建立革兰氏阴性菌例如大肠杆菌生物被膜的体外模型，测定抗生素例如多粘菌素对大肠杆菌生物被膜的最低抑制浓度(BIC)和最小生物膜清除浓度(MBEC)。微生物形成生物被膜后，对粘菌素的耐药程度增加，其BIC和MBEC值均增加，且MBEC值大于BIC值。本研究中建立的大肠杆菌生物被膜体外形成实验，与其它方法相比，具有操作简单，易于重复等特点；同时配套设备少，技术要求低，可减少人为因素等误差；适用于较大样本。使得为临床上合理用药提供理论依据。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种快速测定生物被膜中大肠杆菌对抗生素耐药性的方法。

背景技术

抗生素耐药性是全球公共卫生领域面临的巨大挑战。全球范围内，每年由于多重耐药病原菌感染所致的死亡病例达70万，据估计2050年可能会高达100万例。严重的耐药问题使得人类在医学临床、兽医临床和食品安全等领域面临严峻挑战。同时，据报道，每年全球约有百万人因细菌生物被膜感染发病或死亡，细菌形成生物被膜后耐药性极强，可以逃避宿主的免疫作用，在感染部位难以彻底清除，是临床上难治性感染的重要原因之一。因此确定有效的药物浓度，从而抑制生物被膜的形成具有重要意义。

细菌生物膜(bacterial biofilm,BF)是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，由细菌和自身分泌的胞外基质组成。生物被膜耐药问题造成了医疗、食品等领域大量人力、财力的浪费，已成为不可忽视的公共卫生问题。

近些年，革兰氏阴性菌尤其是大肠杆菌耐药率也愈来愈高。大肠杆菌为常见的院内感染革兰氏阴性细菌之一，常能引起多种肠内外的感染。而多粘菌素通常被认为是治疗由多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”。由前所述，如果对多粘菌素耐药的大肠杆菌形成生物被膜，将会对人类健康造成更大的潜在威胁，对此方面研究也具有十分重要的意义。在CLSI标准中，微量肉汤稀释法仅仅是针对浮游状态的细菌所实施的抗菌素敏感实验，这忽略了生物被膜中的细菌，并未把细菌形成生物被膜的情况考虑在内，这个抗菌药物浓度是不能够完全杀死附着在蛋白质或生物材料表面的细菌。因此对大肠杆菌引起的感染进行用药指导时，需考虑到生物被膜形成影响了细菌对抗菌药物的敏感性。但目前尚未有研究生物被膜中大肠杆菌对多粘菌素的耐药性。

本研究利用微量接种针为载体建立大肠杆菌生物被膜的体外模型，测定多粘菌素对大肠杆菌生物被膜的最低抑制浓度(BIC)和最小生物膜清除浓度(MBEC)，为临床合理用药提供依据。

发明内容

本发明的目的在于构建大肠杆菌生物被膜的体外模型，测定大肠杆菌对抗生素耐药性。

通过构建大肠杆菌生物被膜，并检测抗生素对大肠杆菌生物被膜的最低抑制浓度(Biofilm Inhibitory Concentration,BIC)和最小生物膜清除浓度(Minimal BiofilmEradication Concentration,MBEC)，判断大肠杆菌对抗生素的耐药性。

技术方案为，一种构建生物被膜中大肠杆菌对多粘菌素耐药性的方法，步骤包括：

(1)生物被膜构建：

大肠杆菌培养后调节浓度至OD₆₀₀＝0.45～0.5，加到微孔板内，将接种针固定在盖板上，并将盖板固定在微孔板上，使接种针插入微孔板内的菌液中，36～38℃、100～120rpm条件下培养18～30小时，在接种针上形成细菌生物被膜。

优选的培养条件为：37℃、110rpm条件下培养24小时。

优选的，每个微孔内菌液体积为100～200μL，更优选为140～160μL；在本发明的一个优选实施方式中，菌液体积为150μL。