[发明专利]一种检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变的方法

权利要求书

1.一种用于检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变的引物，其特征在于上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

2.权利 要求1所述的引物在检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变种的应用。

3.一种检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变的方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）提取待鉴定的斑点叉尾鮰基因组DNA；

（2）以提取的基因组DNA为模板，以权利 要求1所述的引物为扩增引物，PCR扩增斑点叉尾鮰HSP4基因片段；

（3）扩增产物进行直接电泳，根据电泳图谱结果，进行判定：白化个体有99 bp的碱基缺失，只有一条150 bp条带；正常个体HSP4基因没有变化，只有一条249 bp条带；隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99 bp，导致同时存在150 bp和249 bp一大一小两条带；

或者

（3）扩增产物纯化后，直接测序，根据测序结果，进行判定：白化个体有99 bp的碱基缺失，序列长度为150bp，正常个体序列长度为249 bp，隐性致白化突变携带者个体该基因单链缺乏99 bp，导致峰形图存在重叠峰。

4.根据权利要求3所述的检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变的方法，其特征在于所述的PCR反应体系为50 μL： 50ng/μL的模板DNA 1 μL，PCR缓冲液 5 μL，dNTP混合液4μL ，每种dNTP 0.1mmol/L， 10 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2μL 2 IU 的Taq酶；双蒸水36μL；所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0， 0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01%明胶组成；PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火1min，72 ℃延伸1 min，经35个循环后再72 ℃延伸10 min。

5.权利要求1所述的特异引物在检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变试剂中的应用。

6.一种检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变试剂，其特征在于包含权利要求1所述的引物。

7.根据权利要求5所述的检测斑点叉尾鮰HSP4基因隐性致白化突变试剂，其特征在于还包括PCR缓冲液和dNTP混合液，所述的PCR缓冲液由10mmol/L Tris-HCl，pH9.0，0.5mmol/L KCl，30mmol/L MgCl₂，0.01%明胶组成。