[发明专利]水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1. 一种水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌阳性对照DNA，志贺氏菌引物，小肠结肠炎耶尔森菌引物，副溶血性弧菌引物。

2.根据权利要求1所述的多重降落PCR检测试剂盒，其特征在于所用的志贺氏菌引物序列为：5’-CGCCATATCAGAGTCATCACT-3’与5’-TGCGTGCAGAGACGGTAT-3’。

3.根据权利要求1所述的多重降落PCR检测试剂盒，其特征在于所用的小肠结肠炎耶尔森菌引物序列为：5’- ACCACGGCAATAGTTCTAATC-3’与5’- CGGCAACAATATCAGATGGAGA-3’。

4.根据权利要求1所述的多重降落PCR检测试剂盒，其特征在于所用的副溶血性弧菌引物序列为：5’- TACGCTGAAGATAAACTAACGG-3’与5’- TGCGGAAGAAGACTTACGAG -3’。

5. 一种水中病原菌多重降落PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（一）提取待检样本的DNA

（二）多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的VP1332、inv基因与ipaH序列，具体步骤如下：

反应体系：25 µl，包括H₂O 7.65 µl，缓冲液（10×PCR）2.5 µl，BSA（10 mg/ml）0.25 µl，VP_VP1332-F（10 µmol/L）0.2 µl，VP_VP1332-R（10 µmol/L）0.2 µl，Ye_inv-F（10 µmol/L）3 µl，Ye_inv -R（10 µmol/L）3 µl，Sh_ipaH-F（10 µmol/L）0.2 µl，Sh_ipaH-R（10 µmol/L）0.2 µl，MgCl₂（25 mM）2.5 µl，dNTP（2.5 mM）3 µl，Taq DNA聚合酶（5U/µl）0.3 µl，DNA模板2 µl

引物：

志贺氏菌引物为：

Sh_ipaH-F：5’-CGCCATATCAGAGTCATCACT-3’

Sh_ipaH-R：5’-TGCGTGCAGAGACGGTAT-3’

小肠结肠炎耶尔森菌引物为:

Ye_inv-F：5’-ACCACGGCAATAGTTCTAATC-3’

Ye_inv-R：5’-CGGCAACAATATCAGATGGAGA-3’

副溶血性弧菌引物为：

VP_VP1332-F：5’- TACGCTGAAGATAAACTAACGG-3’

VP_VP1332-R：5’- TGCGGAAGAAGACTTACGAG-3’

（三）PCR反应循环参数如下：

94℃ 5min；94℃ 30s, 61℃（每循环降低0.5℃）30 s, 72℃ 1 min，20个循环；94℃30s, 51℃ 30s, 72℃ 1 min, 20个循环；72℃ 7 min

（四）电泳检测鉴定：

对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有870 bp、393 bp、193bp条带则分别代表检出副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、志贺氏菌。