[发明专利]水体中三种病原菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种可同时快速检测水样中志贺氏菌（shigella spp）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）与副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法。本发明属于水样中感染性疾病的分子诊断技术领域，拟解决水样中病原菌的快速诊断。本发明设计了志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌的特异性引物，并建立了可同时检测这些细菌的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法，采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。本发明建立的多重降落PCR检测试剂盒及检测方法快速、简便、特异、灵敏，可用于志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌感染的快速诊断与流行病学调查。

技术领域

本发明涉及水样中感染性疾病的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR检测方法在水样中志贺氏菌（shigella spp）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）与副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）检测中的应用。

背景技术

志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌及副溶血性弧菌是引起水源性疾病的主要病原菌。水在人类日常生活中必不可少，水中的致病菌不仅可引起人类腹痛、呕吐、腹泻等胃肠道症状，还能引起呼吸系统、心血管系统、骨骼结缔组织等疾患，甚至可引起败血症，造成死亡。不仅造成了巨大的经济损失和严重的环境污染，更重要的是危及人们的健康甚至生命。当前志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌及副溶血性弧菌的常规检测方法基于培养法，操作耗时且灵敏度低。

Liu, B.等（Liu, B., et al., Development of a real time PCR assay for rapid detection of Vibrio parahaemolyticus from seafood. Protein Cell, 2012.3(3): p. 204-12.）发现VP1332基因可作为检测副溶血性弧菌的特异性标志物。Zheng, H.等（Zheng, H., et al., Investigation of virulence genes in clinical isolates of Yersinia enterocolitica. FEMS Immunol Med Microbiol, 2008. 53(3): p. 368-74.）调查了小肠结肠炎耶尔森菌株中特异性毒力基因的分布率，发现inv基因占100%。Vu,D.T.等（Vu, D.T., et al., Detection of Shigella by a PCR assay targeting the ipaH gene suggests increased prevalence of shigellosis in Nha Trang, Vietnam.J Clin Microbiol, 2004. 42(5): p. 2031-5.）发现ipaH基因可作为检测志贺氏菌的特异性毒力基因。Korbie, D.J.等（Korbie, D.J. and J.S. Mattick, Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols,2008. 3(9): p. 1452-1456.）发现降落PCR可提高PCR的特异性与灵敏度。当前尚无可同时检测志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌的多重降落PCR的报道。本发明建立的多重降落PCR可同时直接检测水中的副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌与志贺氏菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌与副溶血性弧菌感染的快速诊断与流行病学调查。