[发明专利]利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法

权利要求书

1.一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，采用噬菌体展示技术，结合全细胞筛选模式，筛选具有细胞膜穿透活性的多肽；再利用所筛选的胞穿透肽构建细胞穿透肽原核表达文库。

2.根据权利要求1所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，选用Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库，将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pIII中，使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白，从而构建成一个组合文库；

所述全细胞筛选模式是指以培养细胞为对象，加入噬菌体随机环七肽库进行的筛选。

3.根据权利要求2所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，包括如下步骤：

0.以噬菌体随机环七肽库作为噬菌体筛选基，令筛选次数n＝1，进入步骤a；

a.将噬菌体筛选基加入培养细胞上清中孵育1-2小时；

b.冰上终止反应，弃去上清中未结合噬菌体；

c.培养基洗涤细胞10次以上，以去除细胞表面噬菌体；

d.胰酶消化细胞至圆缩，再进行离心处理，之后反复洗涤细胞3-5次，以去除与细胞膜有特异性结合的噬菌体；

e.细胞沉淀置于液氮和37℃恒温水浴锅中反复冻融5-10次，在每次冻融过程中分别震荡30秒；然后

向冻融物中加入含表面活性剂的缓冲液，于室温作用1小时以上，以裂解细胞；

f.离心后的裂解上清即为淘选分离液，取100μl淘选分离液测定噬菌体滴度；向其余裂解液中加入对数期大肠杆菌以及含有抗生素的LB培养基10-50ml，再于37℃剧烈振摇培养4-6小时；

g.离心培养物，将70％-90％的上清液上部转入一新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，混匀，并于4℃沉淀过夜；

h.沉淀物重悬于含0.02％NaN₃/TBS缓冲液中，离心上清，再用1/6体积的PEG/NaCl二次沉淀；

i.沉淀物重悬后离心，上清转入新的离心管，即得到噬菌体扩增液，测定噬菌体滴度；

j.判断筛选次数n是否小于或者等于筛选截止次数s，s为自然数，如果是，则进入步骤l；如果否则进入步骤k；

k.以步骤i得到的噬菌体扩增液作为噬菌体筛选基，令n＝n+1，返回步骤a；

l.提取经过筛选过后的噬菌体总DNA；

m.用含有酶切位点的上下游引物，以提取的噬菌体单链DNA为模板，扩增目的片段，插入带有荧光蛋白DNA的原核表达载体中；

n.将连接产物转化入原核表达菌株中，即得到细胞穿透肽原核表达文库。

4.根据权利要求3所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，噬菌体滴度测定方法为：

1).接种大肠杆菌菌落于培养基中，37℃剧烈振摇，培养至对数中期；

2).取噬菌体淘选分离液和扩增液，在培养集中进行10倍系列稀释，稀释范围为10⁹-10¹¹；

3).当细菌培养物达对数中期时，分成100-200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管；

4).向离心管中每管加入10-20μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育感染；

5).将感染的细菌加入预温的顶层琼脂玻璃试管中，每次一管，快速混匀，在6分钟内倾注于37℃预温的筛选平板上，倾斜平板将上层琼脂均匀铺开；

6).待平板冷却凝固，倒置于37℃培养箱培养过夜；检查平板，计数10²数量级噬菌斑平板上的斑数，然后用此数目乘以稀释因子即得到噬菌体的滴度，即空斑形成单位。

5.根据权利要求4所述的利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，其特征在于，筛选截止次数s为3或4。