[发明专利]利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法

说明书

一种利用噬菌体展示技术构建细胞穿透肽表达文库的方法，采用噬菌体展示技术，结合全细胞筛选模式，筛选具有细胞膜穿透活性的多肽；再利用所筛选的胞穿透肽构建细胞穿透肽原核表达文库。选用Ph.D.‑C7C噬菌体展示肽库，将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pIII中，使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白，从而构建成一个组合文库。本发明方法所构建的文库阳性克隆率远高于随机多肽文库，筛选和验证所需时间周期大大缩短，具有高通量的优势。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及噬菌体展示、细胞培养技术、原核表达文库构建和分子荧光技术，具体涉及利用噬菌体展示技术筛选细胞穿透多肽的方法以及利用筛选得到的多肽构建原核表达文库，从而对多肽的穿透能力进行验证和比较的方法。

技术背景

细胞膜是一种具半透性的生物膜，其特性构成了细胞内外物质选择性交换的基础，因而对于维持细胞的生存和正常功能的发挥具有关键性作用。然而，由于存在着这一天然的有效屏障，一些被证明具有良好治疗效果和疾病诊断价值的生物大分子和传感分子，例如非脂溶性的蛋白、抗体、多肽、核酸、极性药物分子、探针以及显像剂等却很难到达细胞内发挥应有的作用。尤其在目前肿瘤药物靶向的治疗研究中，已开发出来的肿瘤单克隆抗体由于只能与细胞膜表面的特异性表位结合，难以携带药物分子进入细胞内部，从而使得细胞内输送载体的研究也成为该领域关注的焦点。目前已得到应用的显微注射、脂质体转染、病毒包被、化学修饰等方法，虽然能够将物质导入细胞，但是都不同程度地存在着分子活性下降、导入效率低下、细胞种类受限以及造成细胞损伤等问题，多停留在实验室研究阶段，难以推广和应用于临床治疗。

上世纪末以来，细胞穿透肽(cell-penetratingpeptides,CPPs)得到了陆续发现和深入研究，这一领域开启了细胞内输送载体研究的新纪元，细胞穿透肽亦被证明是目前实现细胞内运输最为有效的手段之一(Adv Drug DeliverRev,2009,61:953-964)。关于CPPs的首次报道出现在1988年，Frankel等发现来源于人免疫缺陷病毒HIV-1转录激活因子的蛋白Tat具有穿透细胞膜和核膜，并锚定于特异基因调控区的能力(Cell,1988,55:1189-1193)。随后研究还发现，Tat蛋白中的一段长度为11个氨基酸残基的碱性氨基酸序列YGRKKRRQRRR发挥了蛋白转运的作用(JBiol Chem,1997,272:16010-16017)。此后，来源于果蝇触角蛋白(antennapediaprotein ofDrosophila)的多肽penetratin被首次成功地运用于外源性肽类的细胞内输送(J Biol Chem,1994,269:10444-10450)。后续的研究证实，CPPs可以有效的将亲水性蛋白质、多肽、核酸片段大分子物质，极性化学分子甚至量子点等，导入种类广泛的细胞中，不仅能够保证活性分子正常发挥作用，并且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。尤其是某些CPPs能够携带货物分子穿过血脑屏障、血睾屏障、胎盘屏障等人体重要的屏障系统发挥作用(Chem Commun,(Camb.)2005,3144-3146)。因而，CPPs作为有效的生物活性分子细胞内外转运工具，在细胞生物学、细胞免疫学、药物开发、基因生物治疗以及肿瘤靶向治疗等研究领域，均具有广阔而重要的应用前景(Adv Drug DeliverRev,2009,61:953-964)。