[发明专利]一种DAO蛋白的制备和纯化方法及其应用

权利要求书

1.一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、质粒制备：以cDNA为模板，加入引物进行PCR，进行30次循环后，以Pro-Taq将DAO基因扩增后，将DAO经过酶NdeI与XhoI处理后将其接入pET23a(+)质粒中，通过琼脂凝胶体电泳分析和DNA胶体片段纯化，得到纯化后的PCR产物，以限制酶NdeI及XhoI处理纯化过后的DAO片段与pET23a(+)载体，使得DAO-6H有可与pET23a(+)互补的回文序列，以琼脂胶将载体和DAO片段自胶体纯化，并以限制酶HindIII及BamHI处理纯化，加入连接酶及缓冲液于25℃下反应2小时，使DAO接合入pET23a(+)载体中，接着转化入大肠杆菌Top10F’，于37℃培养至隔日，并以菌落PCR法确认连接成功之后将菌落挑起送测序公司测序，确认序列正确无误后即完成质粒制备，完成质粒制备后即大肠杆菌TOP10F’大量表达带有His-tag的DAO-6H；

步骤二、蛋白质的表达：将表达DAO-6H的质粒转入大肠杆菌感受态细胞菌株，挑取单一颗菌落培养于LB培养液中，且于培养液中外加氨苄西林和氯霉素，于37℃隔夜培养后，从培养液中取出0.5ml加入5ml新鲜的LB于37℃培养，当菌体浓度达到OD600至0.4-0.6时，将温度维持于25℃，外加最终浓度为0.5mM的异丙基硫代半乳糖苷，隔夜培养后，取出1ml菌体于4℃下以离心，去除上清液之后加入适量的PBS，超声破碎仪将细胞壁打破，离心之后分离出可溶物与不可溶物；

步骤三、蛋白质的纯化：将表达DAO-6H蛋白的大肠杆菌溶于结合缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂，再以超声破碎仪震破细胞，于4℃，以离心20分钟移除细胞碎片，过滤上清液，将此上清液注入已事先通过结合缓冲液的金属螯合层析管柱，以清洗缓冲液清洗管柱，接着以冲洗缓冲液冲洗出DAO-6H蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述引物为：

pET23a-DAO-6H:

DAO-F’-NdeI:ATATCATATGCGTGTGGTGGTGATTGG

DAO-R’-XhoI:TATACTCGAGGAGGTGGGATGGTGGCATTC。

3.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述结合缓冲液由0.5M NaCl和20mM pH为7.9的Tris-HCl制备而成。

4.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂由1mM苯甲基磺酰氟、0.04mM 1,10-邻菲啰啉、0.04mM盐酸苯甲脒制备而成。

5.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述过滤器的孔径为0.45μm。

6.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述清洗缓冲液由0.5M NaCl、20mM pH为7.9的Tris-HCl、10mM-100mM 1,3-二氮杂戊环制备而成，冲洗缓冲液由0.5M NaCl、20mM pH为7.9的Tris-HCl和300mM-1M 1,3-二氮杂戊环制备而成。

7.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述离心条件为9000rpm-15000rpm。

8.根据权利要求1所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法，其特征在于，所述氨苄西林的浓度为50μg/ml，所述氯霉素的浓度为25μg/ml。

9.一种将根据上述任一权利要求所述的一种DAO蛋白的制备和纯化方法得到的DAO蛋白在治疗精神分裂症药物中的应用。