[发明专利]一种DAO蛋白的制备和纯化方法及其应用

说明书

本发明提出了一种DAO蛋白的制备和纯化方法，包括以下步骤：步骤一、质粒制备；步骤二、蛋白质的表达；步骤三、蛋白质的纯化。所述DAO‑6H的分子量为38kDa，经由Western blotting分析，利用anti‑His抗体侦测发现，DAO‑6H具可溶部份可供纯化。本发明制备的DAO蛋白是精神分裂症中有重要影响的蛋白，其制备和纯化可用于精神分裂症病理的一系列研究中，有助于现代医学对于精神病症的深入研究，对攻克该系列疾病提供了方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种DAO蛋白的制备和纯化方法。

背景技术

遗传学研究发现，精神分裂症发病机制是体内多个致病基因蓄积的结果。随着分子生物学的发展，越来越多的研究证实精神分裂症患者存在基因方面的异常，包括多巴胺D2及D3受体基因、reelin基因、GIuR6基因、MTHFR基因、NRGl基因和bdnf基因等。在哺乳动物中存在D型丝氨酸(D-ser)，后来研究发现包括人类在内的哺乳动物在中枢神经系统存在区域性的高浓度D-ser。研究表明D-ser具有比甘氨酸更强的的激活效能。丝氨酸消旋酶(SR)能够专一性催化L-ser转化为D-ser；DAO存在于哺乳动物中枢神经系统和周围组织中，发挥着促进中性D-ser氧化去氨基的作用，这种酶在D-ser的代谢过程中发挥着重要作用。与正常人相比精神分裂症、重度抑郁和双相精神障碍患者额叶皮质和海马区域的SR分别减少39％和21％，在额叶皮质DAO并无变化，而在海马DAO蛋白明显增加。精神分裂症患者脑脊液D-ser水平是降低的。

DAO，D构象氨基酸氧化酶，是一种以FAD为辅基的黄素蛋白，以二聚体的形式存在于人体肝脏、肾脏与脑中，对受体具有旋光特异性，能将D型氨基酸进行氧化脱氨反应，产生氨及相对应的α型酮酸，同时将氧分子还原成过氧化氢。目前在人脑中已经发现DAO可调控D-serine而影响NMDA受体的活性。在许多文献中指出DAO会降解脑中神经胶细胞的D-serine，此现象可能与精神分裂症相关。虽然DAO早在1988年就被发，但在近几年来才开始有大量关于DAO相关研究被报导出来。

Miranda等首次在正常人血液中分离到了SR基因，研究发现SR基因变异与精神分裂症具有相关性，随后也发现SR基因与精神分裂症密切相关。西安地区DAO基因的多态性与精神分裂症具有相关性。在日本人群对340名正常人和340名精神分裂症患者采用病例对照研究，结果发现DAO单体型与精神分裂症存在关联性。在爱尔兰人群中的研究也发现DAO基因与精神分裂症密切相关。有关D-ser的合成与代谢、在中枢神经系统的分布及存储释放机制国内外已有较多报道，而基因是决定性状的内在因素，目前对于SR和DAO的研究停留在基因序列水平上，由基因上升至蛋白三维结构的性质在国内鲜见报道。三维结构详细信息的缺失，会阻碍对该蛋白的功能、催化机理等的进一步研究。使用同源建模和分子动力学模拟的方法能很好地应用于生物大分子的理论模拟，并指导实验现象。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供一种DAO蛋白的制备和纯化方法及其应用，其目的在于，得到纯度较高的DAO蛋白，通过该纯化的DAO蛋白，用于精神分裂症病理的一系列研究中，有助于现代医学对于精神病症的深入研究，对攻克该系列疾病提供了方法。

本发明提供一种DAO蛋白的制备和纯化方法，包括以下步骤：