[发明专利]分离的植物防御素多肽及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种分离的植物防御素多肽，其特征在于，所述分离的植物防御素多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.一种分离的核苷酸，其特征在于，所述分离的核苷酸序列的序列为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的分离的核苷酸，其特征在于，所述分离的核苷酸编码权利要求1所述的分离的植物防御素多肽。

4.一种从植物浆果中分离获得权利要求1所述的分离的植物防御素多肽的方法，其特征在于，包括：

（1）将所述植物浆果预冷后粉碎，然后进行酒精浸泡处理；

（2）将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末；

（3）将所述干燥的浆果粉末依次进行硫酸浸泡处理和第一离心处理，以便收获上清液；

（4）将所述上清液依次进行MES缓冲液调节、第二离心和第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及

（5）将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽；

所述植物浆果为澳大利亚羞木树浆果。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将所述羞木树浆果预冷后粉碎，并用100%酒精中浸泡4小时；

（2）将经过酒精浸泡处理的果仁依次进行第一过滤、100%酒精浸洗和干燥处理，以便获得干燥的浆果粉末；

（3）利用0.05M的硫酸浸泡所述干燥的浆果粉末2小时，离心、收获上清液；

（4）利用MES缓冲液调节所述上清液至20mM，并于13500rpm下进行第二离心30分钟后，利用0.45μm滤膜进行第二过滤处理，以便获得离子交换层析样品；以及

（5）将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，以便获得所述分离的植物防御素多肽。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（5）中将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离进一步包括：

（5-1）将所述离子交换层析样品进行离子交换柱层析分离，然后用20mMMES缓冲液洗脱，其中所述离子交换柱包括C8硅胶柱和反向C2/C18硅胶柱；

（5-2）依次利用含有0.1%三氟乙酸的5%的乙腈和0.1%三氟乙酸的50%乙腈对所述C8硅胶柱进行第一洗脱处理，以便获得第一洗脱样品；

（5-3）于4摄氏度下，将所述第一洗脱样品进行第一真空干燥浓缩，并将经过第一真空干燥浓缩的样品溶解于含有0.1%三氟乙酸的5%乙腈中，以便获得溶解样品；

（5-4）将所述溶解样品上样至所述反向C2/C18硅胶柱上，并依次利用含有0.1%三氟乙酸的5%的乙腈和0.1%三氟乙酸的50%乙腈对所述C8硅胶柱进行第二洗脱处理，以便获得第二洗脱样品；

（5-5）于4摄氏度下，将所述第二洗脱样品进行第二真空干燥浓缩，并将经过第二真空干燥浓缩的样品溶解于水中反复抽提，以便获得所述分离的植物防御素多肽。

7.一种构建体，其特征在于，包含权利要求2或3所述的分离的核苷酸。

8.一种重组细胞，其包含权利要求7所述的构建体。

9.根据权利要求8所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞为酵母细胞。

10.一种获得权利要求1所述分离的植物防御素多肽的方法，其特征在于，

将权利要求8或9所述重组细胞接种至氨基酸缺陷性液体培养基，进行标准发酵罐深层通气培养80-100小时，以便获得发酵液；

将所述发酵液进行分离纯化，以便获得所述分离的植物防御素多肽。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，进行所述培养96小时。