[发明专利]基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒及其应用，该试剂盒包括检测肾小管上皮细胞特异性基因BBOX1以及内参基因B2M的上下游引物及探针。本发明荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于检测尿液、组织中BBOX1基因表达水平的快速检测。同时在检测过程中mRNA逆转录及荧光定量一步完成，均在单管中进行，勿需打开管盖，荧光信号的产生不仅强烈依赖于靶模板同探针的杂交，而且同时强烈依赖于靶模板的扩增，故不存在非特异性扩增现象。从而可快速、特异、灵敏地检测BBOX1基因的mRNA表达水平。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。

背景技术

肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)为被覆于肾小管内侧的上皮细胞，由中胚层后肾间充质细胞在胚胎第5周转分化而来。正常RTEC代谢活性旺盛，具有重吸收和排泌等多种生理功能。既往研究认为肾小球炎症和硬化是肾脏疾病进展的主要推动者,而肾小管病变仅仅是肾小球病变的受累者,其本身在疾病进展中的作用并不突出。然而，近年来大量研究证据表明,在多种损伤因素刺激下(缺氧、中毒、细胞炎症因子、血浆蛋白或葡萄糖等)，RTEC可发生一系列损伤、活化及表型转化等改变，并释放多种炎症因子和生长因子，促进肾脏疾病的发生发展。不仅如此，肾小管间质病变程度与肾功能下降严重程度和疾病预后密切相关。因此，目前认为RTEC损伤是肾脏疾病的核心病理生理环节之一。

RTEC受到损伤后可脱落入尿液，导致尿液中RTEC计数显著增加，并可作为多种肾脏疾病的生物标志物。然而，由于形态学上的相似性，RTEC与来自于下尿路的上皮细胞极难鉴别。信使核糖核酸(mRNA)由DNA的一条链作为模板转录而来的、能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。我们最近的研究发现，在众多尿路细胞中，RTEC特异性表达BBOX1 mRNA。检测尿液中相应mRNA水平对提示肾小管损伤以及肾脏疾病的诊断、预后监测具有独特价值。

基于Taqman探针的荧光定量PCR技术通过Taqman探针与模板的特异性杂交来鉴别模板，具有很高的准确性，假阳性率低，特异性好。

发明目的

发明内容：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒。该荧光定量PCR试剂盒具有取材量小、操作简便且检测周期短的优点，能够用于尿液、组织中BBOX1基因表达水平的快速检测。

本发明还提供该基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR试剂盒的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于Taqman探针的肾小管上皮细胞特异性基因检测荧光定量PCR一步法试剂盒，包括检测BBOX1基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1-3所示；检测B2M内参基因的上下游引物及探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4-6所示。

其中，所述PCR试剂盒还包括PCR酶混合液和MasterMix。

所述PCR酶混合液为m-mlv逆转录酶和RNase inhibitor混合液。其中，m-mlv逆转录酶浓度为1000U/ul，RNase inhibitor浓度为600U/ul。

所述MasterMix包含浓度为100mM的KCl，浓度为6mM的MgCl₂，浓度为80mM、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.6mM的dNTPs，浓度为0.06U/ul的热启动Taq酶，以及0.2M的PCR增强剂。

其中，所述BBOX1和B2M基因的探针连接的荧光基团为：FAM-BHQ 1。

进一步地，所述探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端连接淬灭基团。