[发明专利]一种一步法同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应用

权利要求书

1.一种miR-486、miR-146b和miR-15b探针设计方法，其特征在于：所述具体方法步骤如下：

步骤一：设计茎环-miR-486序列为SH-(CH2)6-AAA AAC TCG GGG CAG CTC AGT ACAGGA TTT TT-6-FAM，茎环-miR-146b序列为SH-(CH2)6-AAA AAC AGC CTA TGG AAT TCA GTTCTC ATT TTT-Cy5，茎环-miR-15b序列为SH-(CH2)6-AAA AAT GTA AAC CAT GAT GTG CTGCTA TTT TT-Cy3；

步骤二：步骤一中的三种茎环结构3′端修饰了不同荧光分子，FAM修饰茎环-miR-486，Cy5修饰茎环-miR-146b，Cy3修饰茎环-miR-15b，5′端通过金-巯键修饰到金纳米表面。

2.一种探针修饰AuNPs的方法，其特征在于：所述具体修饰步骤如下：

步骤一：取粒径为50nm的100μL AuNPs，加入TCEP、茎环-miR-486、茎环-miR-146b和茎环-miR-15b；

步骤二：室温下孵育，冷藏备用，TCEP终浓度为1mM，三种茎环的终浓度为0.5μM。

3.一种同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应用，其特征在于：所述具体操作步骤如下：

步骤一：AuNPs功能化修饰，加适量TM缓冲液分别溶解合成的三种miRNA探针至100μM的终浓度，再取适量TM缓冲液分别稀释三种miRNA探针至10μM，置于95℃金属浴热击10分钟，然后迅速置于4℃，取粒径为50nm的100μL AuNPs，加入TCEP、茎环-miR-486、茎环-miR-146b和茎环-miR-15b，室温下孵育，冷藏备用，TCEP终浓度为1mM，三种茎环的终浓度为0.5μM；

步骤二：浓度梯度测定，取经步骤一中修饰过的AuNPs，加入浓度范围为1pM-100nM的miR-486、miR-146b和miR-15b，然后室温孵育，进行三种荧光强度检测，荧光测量均由F2500荧光光谱仪实现，各荧光分子的激发和发射波长如下：6-FAM为495nm和521nm，Cy3为550nm和570nm，Cy5为649nm和670nm，6-FAM在495nm处激发，Cy3的激发光为550nm，Cy5为649nm，在521nm处测量6-FAM荧光信号，570nm处检测Cy3荧光信号，670nm处检测Cy5荧光信号，所有激发和发射狭缝宽度均设置为5nm，PMT电压为800V，所有这些检测都记录在室温下，最后得到荧光强度与miRNA浓度的线性关系；

步骤三：利用步骤二所得的标准曲线法对待测样本进行分析检测，分析miR-486、miR-146b和miR-15b的含量；

步骤四：将步骤三中同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法应用于肥胖儿童血液中miR-486、miR-146b和miR-15b的检测，预示未来患成人T2D风险。

4.根据权利要求2所述的一种探针修饰AuNPs的方法，其特征在于：所述步骤二中室温孵育时间为1.5h，冷藏备用温度为4℃。

5.根据权利要求3所述的一种同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应用，其特征在于：所述步骤一中室温孵育时间为1.5h，冷藏备用温度为4℃，所述步骤二中室温孵育时间为10min。