[发明专利]一种一步法同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种miR‑486、miR‑146b和miR‑15b探针设计方法，所述具体方法步骤如下：步骤一：设计茎环‑miR‑486序列为SH‑(CH2)6‑AAA AAC TCG GGG CAG CTC AGT ACA GGA TTT TT‑6‑FAM。本发明通过设计三种茎环结构3′端修饰了不同荧光分子，FAM修饰茎环‑miR‑486，Cy5修饰茎环‑miR‑146b，Cy3修饰茎环‑miR‑15b，5′端通过金‑巯键修饰到金纳米表面，由于茎环的特殊结构，荧光分子将与金纳米表面接触，荧光猝灭，当目标miRNA存在，由于碱基互补配对，打开茎环结构，使得荧光信号分子远离金纳米表面，从而可检测到相应荧光信号大大增加，实现了对转录因子三种miRNA的快速同时检测，具有良好的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应用领域， 特别涉及一种一步法同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及其应 用。

背景技术

2型糖尿病(T2D)是一种以胰腺β为特征的长期代谢紊乱。细胞破坏和 胰岛素抵抗，是主要的心血管疾病的贡献者。目前已经明确儿童肥胖促进成 年后T2D的发病率。因此，鉴别有发展为T2D风险的肥胖儿童，预防病理发 生过程将有助于减少成人T2D的发生。然而，目前缺乏很好的早期诊断方法。 我们前期研究发现了3个miRNAs，miR-486、miR-146b和miR-15b在肥胖儿 童和T2D患者中稳定地显著高表达。这三个miRNA表达水平能够预示肥胖儿 童未来患成人T2D风险。

目前检测miRNA的方法主要有Northern印迹分析，微点阵(microarray) 分析和实时定量PCR(quantitative Real-Time PCR)。这些方法各有优点， 但是也存在着耗时长、操作复杂，需要昂贵仪器等弊端。因此，现在存在对 操作反应简单、体系稳定、可同时检测、灵敏度好，响应快速的免疫标记和 检测技术的需求。

近年来，利用纳米材料开发可同时检测多种目标分子的检测方法是当前 开发新型传感器的一个热门方向，例如，Kelley小组采用了多种贵金属纳米 颗粒标记抗体和电化学溶出技术，构建了一种采用基于电化学平台的检测抗 原抗体反应的方法。Fan小组利用微流控技术和具有不同发射光的量子点纳米 颗粒，报道了一种基于量子点的微流控平台来同时检测两种肿瘤标志物的方 法；Wang小组报道了一种利用磁纳米颗粒的多通道微芯片来实现同时检测多 种疾病标志物；但是，迄今为止，还没有可以快速同时检测miR-486，miR-146b 和miR-15b的方法。

因此，发明一种一步法同时检测miR-486、miR-146b和miR-15b的方法及 其应用来解决上述问题很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种一步法同时检测miR-486、miR-146b和 miR-15b的方法及其应用，通过设计三种茎环结构3′端修饰了不同荧光分子， FAM修饰茎环-miR-486，Cy5修饰茎环-miR-146b，Cy3修饰茎环-miR-15b，5′ 端通过金-巯键修饰到金纳米表面，由于茎环的特殊结构，荧光分子将与金纳 米表面接触，荧光猝灭，当目标miRNA存在，由于碱基互补配对，打开茎环 结构，使得荧光信号分子远离金纳米表面，从而可检测到相应荧光信号大大 增加，实现了对转录因子三种miRNA的快速同时检测，具有良好的灵敏度和 特异性，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种miR-486、miR-146b 和miR-15b探针设计方法，所述具体方法步骤如下：