[发明专利]一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器

说明书

本发明公开了一种高通量miRNAs表达谱的检测方法及生物传感器。所述高通量miRNAs表达谱的检测方法，包括以下步骤：(1)探针制备；(2)生物传感器制备；(3)miRNA表达谱检测。所述生物传感器，包括氧化石墨烯基质、以及具有特异发射光谱的量子点标记的miRNA‑量子点探针，所述miRNA‑量子点探针通过π‑π堆积作用与所述氧化石墨烯基质吸附。本发明设计简单、扩增特异性高、成本低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种高通量miRNAs标志物的检测方法生物传感器。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为19～24个核苷酸的非编码小RNA分子，在生物进化中相对保守，不编码蛋白质，但它能通过直接与靶mRNA 3’非翻译区的结合以此调节靶基因。研究表明，miRNAs可调控约60％的基因表，在细胞发展的过程如发育、变异、增殖和细胞凋亡中扮演着重要角色，在疾病的各个发展阶段发挥着非常重要的作用。多种miRNAs在各种肿瘤中 (如肺癌、乳腺癌、结肠癌等)呈现异常表达。表达上调的miRNAs可能发挥与癌基因相似的作用(即促癌作用)，而表达下调的miRNAs可能发挥与抑癌基因有相似的作用(即抑癌作用)，这对肿瘤的临床诊断、治疗方案的选择和预后具有十分重要的指导意义。因而，miRNAs作为一种新型的肿瘤标志物，备受关注。

miRNAs具有低丰度，高序列同源性和短序列的特征。正是这些特征使得miRNAs的检测困难重重。目前检测低含量miRNAs的主要方法之一是聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction,PCR)，但由于其序列短，不能直接作为PCR扩增的模板，因此目前多采用逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)。由于其广泛的动态范围和高精度，已成为miRNAs定量的“金标准”方法。miRNA的逆转录方法，常见的有两种：一种是茎环RT引物法，另一种是聚A聚合酶法。Schmittgen等开发了SYBR Green RT-PCR方法来定量前体和前体miRNA。改进后的方法大大提高了RT- PCR的效率，提高检测miRNA的灵敏度和特异性，但是需要复杂的设计和昂贵的费用，具有一定的局限性(Methods,2008,44:31-38)。恒温核酸扩增技术(Isothermal Nucleic Acid Testing,INAT)是在恒定温度下扩增核酸的技术，与PCR、定量RT-PCR等核酸扩增方法相比，最大的区别就在于其反应温度的单一性。因此INAT技术在水浴锅、金属浴，甚至在一个保温效果好的保温杯中即可完成反应，大大缩减甚至消除了PCR等技术所需要的精密而复杂的变温仪器，大大简化了核酸检测的操作步骤，非常适用于现场与临床快速检测。常见的有依赖于核酸序列的扩增、滚环扩增、等温指数扩增等，但都存在设计复杂、非特异性扩增、扩增效率低下等问题。

同时，miRNA的表达模式相比单一miRNA的表达量而言，能更准确的反映细胞状态和生理病理过程，然而目前尚无技术能一次批量检测多中miRNA 的表达量从而构建miRNA的表达模式图谱。目前的miRNA表达模式图谱是多次检测获得的miRNA表达丰度谱，不能准确反映细胞的状态。

量子点(quantumdots,QDs)又称半导体纳米微晶体，是一种纳米材料，由于其高量子产率和宽激发范围，在一个可检测到的光谱范围内，可同时使用多个探针而发射光谱不出现交叠，是组合检测多种miRNAs生物标志物的理想荧光标签。氧化石墨烯，作为一种单原子二维无机碳纳米材料，由于其独特的物理性质，潜在的应用于纳米电子器件、透明导体和纳米复合材料等，迅速在材料领域崛起。2012年，cui等人使用了基于氧化石墨烯保护的酶循环放大的方法来对复杂样品中多种miRNA进行单一分析(Chemical Communications,2012,48:194-196)。这种方法利用氧化石墨烯本身能够吸附探针，并对多种荧光具有淬灭作用，能区分极为相似的不同miRNA的序列。由于简单易得，相对金属氧化物，对环境污染和人体健康伤害小，氧化石墨烯越来越受到研究者们的青睐。但相关研究大多局限于单个miRNA分子的检测或者多个激发光分别检测，费时费力，成本较高。

发明内容