[发明专利]一种体外扩增脐血NK的方法

权利要求书

1.一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于它的具体步骤如下：

一、在T75培养瓶中按体积比为1:4的比例加入包被液和生理盐水；1mL包被液中包含成分：浓度为3～7μg/mL的CD16单抗、浓度为800～1200μg/mL的IFN-γ和浓度为400～600IU/mL的GM-CSF；摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用生理盐水洗瓶底一次，去除生理盐水，放置T75培养瓶备用；

二、脐血中单个核细胞的激活

A、单个核细胞的分离：

将80～100mL的脐血分装于离心管中，在650g，室温条件下离心15min，去除上层浅黄色血浆后，加入与上层浅黄色血浆等体积的生理盐水，得稀释的脐血；另取离心管，加入淋巴细胞分离液，并将稀释的脐血加入到淋巴细胞分离液中，使稀释的血液与淋巴细胞分离液分层，然后在650g，室温条件下离心30min，去除部分上清后，吸取中间的白膜层至离心管中，然后加入等体积的生理盐水，于室温260g离心10min，去除上清，洗涤三次，并计数；

其中，淋巴细胞分离液与稀释的脐血的体积比为15:45～50；

B、单个核细胞的激活：

将上一步去除上清后的沉淀按细胞密度为2.0×10⁶个/mL接种于GT-T551H3无血清培养基，并加入因子，形成混合液；将混合液置于步骤一包被后的T75培养瓶内，然后在温度为37℃、体积百分含量为5％的CO₂饱和湿度的培养箱中培养1～5d；并在第3d按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液，第5d转袋并按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液；

其中，因子由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21混合而成；且混合液中IL-2的浓度为400～600IU/mL，IL-7的浓度为8～12ng/mL，IL-15的浓度为80～120ng/mL，IL-21的浓度为150～200ng/mL；

此步骤所述的补液为含浓度为400～600IU/mL的IL-2、浓度为8～12ng/mL的IL-7、浓度为40～60ng/mL的IL-15和浓度为80～120ng/mL的IL-21的GT-T551H3无血清培养基；

三、脐血NK细胞的体外扩增

在上一步培养5d后，每隔2d按细胞密度0.8～1.0×10⁶个/mL补液，扩增后，即完成所述的体外扩增脐血NK方法；

此步骤所述的补液为含浓度为400～600IU/mL的IL-2、浓度为8～12ng/mL的IL-7、浓度为40～60ng/mL的IL-15和浓度为80～120ng/mL的IL-21的GT-T551H3无血清培养基。

2.根据权利要求1所述的一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于1mL包被液中包含成分：浓度为5μg/mL的CD16单抗、浓度为1000μg/mL的IFN-γ和浓度为500IU/mL的GM-CSF。

3.根据权利要求1所述的一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于淋巴细胞分离液与稀释的脐血的体积比为15:50。

4.根据权利要求1所述的一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于因子由IL-2、IL-7、IL-15和IL-21混合而成；且混合液中IL-2的浓度为500IU/mL，IL-7的浓度为10ng/mL，IL-15的浓度为100ng/mL，IL-21的浓度为180ng/mL。

5.根据权利要求1所述的一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于步骤二补液为含浓度为500IU/mL的IL-2、浓度为10ng/mL的IL-7、浓度为50ng/mL的IL-15和浓度为100ng/mL的IL-21的GT-T551H3无血清培养基。

6.根据权利要求1所述的一种体外扩增脐血NK的方法，其特征在于步骤三补液为含浓度为500IU/mL的IL-2、浓度为10ng/mL的IL-7、浓度为50ng/mL的IL-15和浓度为100ng/mL的IL-21的GT-T551H3无血清培养基。