[发明专利]一种体外扩增脐血NK的方法

说明书

一种体外扩增脐血NK的方法，它涉及一种扩增脐血NK的方法，本发明的目的是为了解决现有脐血NK扩增方法复杂，成本高，由于引入动物源成分，安全性不高，体外扩增时间长，细胞纯度低的问题，本发明通过加入多种细胞因子促进脐血NK细胞的增殖，增强NK细胞的活性。本发明操作简单，成本低，不引入动物源成分，安全性高。本发明培养15天即可收获脐血NK细胞，且细胞纯度为95.33％，细胞总数120亿/份脐血，对肺癌A549细胞杀伤效果较好。

技术领域

本发明涉及一种体外扩增脐血NK的方法。

背景技术

近十年来，手术和化疗已被用作消除肿瘤的主要方法。然而，机体对抗肿瘤药物所产生的耐药性导致肿瘤复发的几率显著升高。因此，迫切需要研究出行之有效的方法来解决肿瘤复发的难题。最近的研究表明，免疫系统在抑制恶性肿瘤发病中具有重要作用。自然杀伤细胞(Nature killer cell,NK)源于骨髓中的造血前体细胞，广泛分布于不同的组织中，如外周血，脾脏，肺，肝脏和子宫中。正常人外周血中NK细胞占淋巴细胞的5％-10％，在脐血中占淋巴细胞的10％-20％，大量的研究已经证实了NK细胞在癌症免疫中的作用及治疗潜力，同时揭示了实体瘤及血液恶性肿瘤的发生与NK细胞的功能受损有关。NK细胞具有有效的抗肿瘤功能，可选择性识别杀伤高表达NK细胞活化性受体的配体、低表达MHC I类分子的“非己”的肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的生长和转移，进而有效地清除肿瘤。

肿瘤患者的免疫系统较健康人差，且部分患者前期已进行放化疗，致使免疫细胞质量及扩增能力均较差，同时，大量临床研究表明，自体NK细胞回输治疗效果欠佳，主要是因为NK细胞表面存在抑制性KIR分子，其可识别自身HLA-I类分子并与之结合，从而抑制NK细胞的激活。脐带血中NK细胞比例显著高于外周血中NK细胞，同时脐血中存在大量CD34+干细胞，可以通过因子诱导进行分化为NK细胞，且脐血来源较为丰富，因此，可以以脐血作为NK细胞的扩增材料，对其中NK细胞及干细胞进行体外诱导分化及扩增，从而为肿瘤治疗提供异体NK细胞，为免疫治疗提供最佳方法。

目前，已经报道了多种体外扩增NK细胞的方法，从而达到更高的细胞治疗剂量，并增强活性和体内增殖潜力。例如滋养层法和因子法，滋养层法是加入肿瘤细胞系，如K562细胞等，其释放的外泌体可促进正常的造血干细胞转化，从而刺激NK细胞的增殖，但可能在NK回输治疗过程中导致肿瘤细胞发生的风险；因子法是加入促进NK细胞分化及增殖的相关因子，如白介素-2(IL-2)、白介素15(IL-15)等，可增强NK细胞活性，维持NK细胞长期生长，且不引入风险，安全性较高。IL-15在NK细胞的分化发育过程中起着重要作用，已有研究证实IL-15可促进脐血中分离的CD34+细胞定向分化为NK细胞，IL-21即白细胞介素-21，分子结构与IL-15相似，参与调节B细胞增殖，协同IL-15促进骨髓前体细胞增殖及NK细胞增殖、分化和细胞毒活性。

NK细胞具有抗肿瘤作用，在临床应用上越来越受到重视。临床应用回输时，NK细胞需要达到一定量的细胞数和较高的细胞纯度，因此在体外扩增脐血NK细胞时如何获得更高的细胞治疗剂量和较高的纯度成为肿瘤治疗的关键。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有脐血NK扩增方法复杂，成本高，由于引入动物源成分，安全性不高，体外扩增时间长，细胞纯度低的问题，而提供一种体外扩增脐血NK的方法。

本发明的一种体外扩增脐血NK的方法，它的具体步骤如下：

一、在T75培养瓶中按体积比为1:4的比例加入包被液和生理盐水；1mL包被液中包含成分：浓度为3～7μg/mL的CD16单抗、浓度为800～1200μg/mL的IFN-γ和浓度为400～600IU/mL的GM-CSF；摇晃细胞瓶使包被液铺满瓶底，室温下静置1h，去除包被液，用生理盐水洗瓶底一次，去除生理盐水，放置T75培养瓶备用；

二、脐血中单个核细胞的激活

A、单个核细胞的分离：