[发明专利]一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总RNA，然后合成第一链cDNA；

(2)设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的引物；并在正、反向引物中分别引入BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制酶切位点核酸序列；

正向引物序列：5′-CGCGCGGGATCCATGGATTCAAATATAAAATATAT-3′；反向引物序列：5′-CGCGCGAAGCTTCTACTGGGTCATTTTCAGAGGC-3′；

以淡足侧沟茧蜂成蜂触角cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳，回收目的片段；

(3)将目的片段用内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；同时将pET32a(+)质粒用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行双酶切和纯化；纯化后的酶切产物在T4DNALigase体系下过夜连接；连接产物转化感受态菌株Trans1-T1并测序，将测序正确的样品提取质粒；

(4)将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后接种于LB培养基中培养；然后再转接于LB培养基中；且做空载体pET32a(+)质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)的对照；

(5)重组蛋白表达条件的优化；

(6)目的蛋白的分离纯化；即得寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8。

2.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，总反应体系为20μL，包括：5×RT Reaction Mix 4μL，Random Primer 1μL，HiFi H^﹣RTase/RIMix 0.8μL，RNase free H₂O 4.2μL，总RNA 10μL。

3.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增总反应体系为20μL，包括正反引物各0.4μL，10×Tag buffer 2μL，dNTPs 0.4μL，TaqDNA polymerase 0.4μL，cDNA 2μL，ddH₂O 14.4μL；反应条件：94℃预变性10min，94℃30s，50℃30s，72℃1min30s；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)具体为：将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后接种于10ml含氨苄青霉素50ug/ml的LB培养基中，在摇床37℃，200r/min的条件下，振荡培养10h；然后按1:100比例转接于50ml LB培养基中；且做空载体pET32a(+)质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)的对照。

5.根据权利要求1所述的寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(5)具体包括：通过检测培养液不同的OD₆₀₀值；在不同的诱导温度、不同诱导持续时间和不同的IPTG诱导浓度条件下，SDS-PAGE分析寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的表达量，得出最佳诱导条件。