[发明专利]一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。寄生蜂气味结合蛋白的制备方法包括以下步骤：一、淡足侧沟茧蜂气味结合蛋白基因的获得，包括（1）提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总RNA，然后合成第一链cDNA；（2）设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的引物；（3）将目的片段进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；（4）将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后进行培养；二、重组蛋白表达条件的优化；三、目的蛋白的分离纯化，包括菌体的收集、破碎；目的蛋白的分离纯化和浓缩。本发明得到的可溶性寄生蜂气味结合蛋白质量稳定可靠，对于研究其识别机制具有重要意义，具有较好的市场价值和社会价值。

技术领域

本发明涉及生物工程方法技术领域，具体是一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。

背景技术

昆虫主要通过嗅觉识别外界的化学信号，化学感知在昆虫的觅食、交配和躲避天敌活动中，起着至关重要的作用。昆虫在长期的进化过程中，形成了一套精密的嗅觉感受系统，嗅觉感官主要分布在昆虫的触角上，通过触角能够感知外界环境的化学刺激。昆虫触角中高表达的气味结合蛋白(Odorant Binding Proteins，OBPs)与嗅觉识别相关。昆虫气味结合蛋白(OBPs)是一类分子量较小(15～20ku)，广泛存在于昆虫的化学感受器淋巴液中的酸性蛋白。其是昆虫与外界进行信息交流的媒介，与外界的气味物质进行相互作用，对于维持昆虫的生命活动起到重要作用。因此克隆得到气味结合蛋白对于研究其识别机制具有重要意义。

淡足侧沟茧蜂Microplitis pallidipes Szepligeti是蔬菜夜蛾中低龄幼虫的优势寄生蜂，是甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾Spodoptera litura田间种群数量的重要调节因子。淡足侧沟茧蜂在田间对寄生昆虫具有较高的寄生效果，田间自然寄生率为6.3％～50％，研究发现淡足侧沟茧蜂能够识别不同健康状况的寄主，这种识别作用主要是通过其嗅觉蛋白即寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8来作用。因此，本发明提供一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种寄生蜂气味结合蛋白及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种寄生蜂气味结合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取淡足侧沟茧蜂成蜂的总RNA，然后合成第一链cDNA；

(2)设计扩增淡足侧沟茧蜂寄生蜂气味结合蛋白MpOBP8的引物；并在正、反向引物中分别引入BamHⅠ和HindⅢ限制酶切位点核酸序列；

正向引物序列：5′-CGCGCGGGATCCATGGATTCAAATATAAAATATAT-3′；反向引物序列：5′-CGCGCGAAGCTTCTACTGGGTCATTTTCAGAGGC-3′；

以淡足侧沟茧蜂成蜂触角cDNA第一链为模板进行PCR扩增，PCR产物经凝胶电泳，回收目的片段；

(3)将目的片段用内切酶HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切后，对酶切产物进行纯化；同时将pET32a(+)质粒用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切和纯化；纯化后的酶切产物在T4DNALigase体系下过夜连接；连接产物转化感受态菌株Trans1-T1并测序，将测序正确的样品提取质粒；

(4)将重组质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)中，之后接种于LB培养基中培养；然后再转接于LB培养基中；且做空载体pET32a(+)质粒转化到表达感受态细胞BL21(DE3)的对照；

(5)重组蛋白表达条件的优化；

(6)目的蛋白的分离纯化。