[发明专利]一种利用微生物发酵制备葡萄糖氧化酶的方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种利用微生物发酵制备葡萄糖氧化酶的方法，其包括第一阶段培养和第二阶段培养；第一阶段培养是将黑曲霉种子液培养30‑40h，然后接入干酪乳杆菌种子液继续培养20‑30h。本发明方法发酵产酶活力高，发酵时间短。

技术领域

本发明属于酶分离技术领域，具体涉及一种利用微生物发酵制备葡萄糖氧化酶的方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）在分子氧存在下，专一催化β-D-葡萄糖氧化成1，5-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，而后葡萄糖酸内酯又自发和水结合产生葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶是酶技术领域中一种非常重要的酶，被广泛应用于食品加工、发酵工业、医学检测。

葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、丁醇、吡啶、甘油、乙二醇等。50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀，一般制品中含有过氧化氢酶。分子量为150000左右，每克分子酶含2克分子FAD。酶的最大光吸收波长为377nm 和455nm。在紫外光下无荧光，但是在热、酸或碱处理后具有特殊的绿色。固体酶制剂在0℃下保存至少稳定两年，在-15℃下稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的pH 值范围为3-4，最适pH值为5，如果没有葡萄糖等保护剂的存在，pH 值大于8 或小于3，葡萄糖氧化酶将迅速失活。葡萄糖氧化酶的作用温度为30-60℃，该酶对EDTA、KCN 及NaF不受阻抑，但HgCl2、AgCl、对氯汞苯甲酸和苯肼对酶有阻抑。在有氧情况下，葡萄糖氧化酶可以从某系统中除去葡萄糖，在过量葡萄糖的存在下可除去氧。基于此原理，葡萄糖氧化酶能广泛应用于各类食品制造，器械除氧防锈等方面。如：蛋品加工中脱糖，防止褐变；果汁、啤酒、食品罐头等的除氧；用于防止虾肉、干鲜食品的氧化；生产葡萄糖酸等。另外，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性，它也被用于一些复杂生化体系中的葡萄糖的定量测定。如：血液中葡萄糖含量测定；制成糖尿试纸用于临床诊断。

葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，由于在动植物体中提取有一定局限性，从酶量来说也不丰富，而霉菌在一定条件下，产生葡萄糖氧化酶的能力强，便于大规模生产葡萄糖氧化酶的主要霉菌来源于霉菌。酶的生产方法可分为提取法、发酵法以及化学合成法。发酵法是20 世纪50 年代以来酶生产的主要方法，是利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶。

葡萄糖氧化酶的生产一般都采用霉菌属的菌株作生产菌。菌株在不同条件下产酶效率差距较大，选择产酶菌株在适合该菌株产酶条件下进行发酵是需要研究的重点。文献“点青霉高产葡萄糖氧化酶菌株的诱变选育，河北省科学学院学报2006年”报道，以产葡萄糖氧化酶的点青霉8312为出发菌株，经紫外线诱变处理，初筛、复筛得到了一株高产葡萄糖氧化酶的菌株，连续12次对其传代试验，该突变株遗传性状稳定，摇瓶产酶水平达到55.7U/mL，比出发株(36.2U/mL)提高了53.9%。文献“产葡萄糖氧化酶黑曲霉的诱变选育及葡萄糖酸钙发酵条件的研究，食品工业科技2010年”公开了采用紫外线和钴60放射线照射对产葡萄糖氧化酶的黑曲霉菌株进行诱变,以含有2-脱氧-D-葡萄糖的选择培养基进行筛选,共获得7个耐受菌株,其中产酶活性最大的U-69菌株的葡萄糖氧化酶活力是出发菌株的2.5倍。研究了U-69菌株合成葡萄糖酸钙的发酵条件,结果显示,最佳发酵条件为葡萄糖150g/L，碳酸钙400g/L,硫酸铵3～4g/L,pH5.5，250mL三角瓶装30mL发酵液,接种量10%，30～34℃发酵18h。在葡萄糖氧化酶发酵生产中，一般采用葡萄糖作为碳源，一方面作为菌体利用的碳源，酶合成的诱导物，另一方面其分解代谢物又能阻遏其生物合成，因此，控制发酵培养基中葡萄糖浓度对菌株发酵产酶影响很大。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种利用微生物发酵制备葡萄糖氧化酶的方法。

本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：

一种利用微生物发酵制备葡萄糖氧化酶的方法，其包括第一阶段培养和第二阶段培养。

具体地，所述方法包括如下步骤：