[发明专利]8种β-内酰胺类抗生素耐药基因荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种8种β‑内酰胺类抗生素耐药基因荧光定量PCR检测方法。本发明针对8类β‑内酰胺类抗菌药物耐药基因(bla_OXA‑1like、bla_VIM‑2like、bla_KPC、bla_NDM、bla_{CTX‑M‑15like}、bla_{TEM‑198like}、bla_CMY‑2like和bla_{CTX‑M‑9like})建立了相应荧光定量PCR方法，该检测方法适用于可培养菌和不可培养菌，并且PCR反应条件相同，从而保证了在同一PCR条件下可以对样品中这8种β‑内酰胺类抗生素耐药基因进行同时检测，对于环境中β‑内酰胺类抗生素耐药性的监测具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，具体涉及一种8种β-内酰胺类抗生素耐药基因荧光定量PCR检测方法。

背景技术

自1929年青霉素应用于临床以来，到目前为止已衍生出多种β-内酰胺类抗菌药物，其中青霉素类和头孢菌素类已成为临床上最常用抗生素，且近年来新开发的β-内酰胺酶抑制剂和非典型的β-内酰胺类抗生素如碳青霉烯类等已成为临床上治疗严重革兰氏阴性菌感染的重要抗生素。

随着β-内酰胺类抗生素在临床及畜牧养殖业的广泛应用，其耐药性问题日益严重。目前，β-内酰胺类抗生素耐药的最主要机制是产生β-内酰胺酶，该酶可以分为四类:1.广谱酶，包括TEM-1，TEM-2，SHV-1这3类酶，可分解青霉素类和窄谱头孢菌素；OXA家族，可分解耐酶青霉素和邻氯青霉素。2.ESBLs，包括TEM和HSV家族，CTX-M家族，OXA家族，可水解青霉素类，Ⅰ～Ⅲ代头孢菌素类和氨曲南，部分还可水解头孢吡肟。3.AmpC酶，包括有ACC-1,ACT-1,CFE-1,CMY家族,DHA-1,FOX家族，LAT家族，MIR-1,MOX-1，可水解超广谱β-内酰胺和头霉素。4.碳青霉烯酶，包括IMP和VIM家族,GIM-1,SPM-1，NDM，KPC，OXA23～OXA-27,40,48。可水解超广光谱β-内酰胺类，头霉素和碳青霉烯类。大量研究表明，临床菌株对于头孢菌素类抗生素耐药性最为严重，在某些医院头孢氨苄的耐药率甚至高达90％左右。产ESBLs肠杆菌科细菌在世界范围内呈广泛流行，其中亚洲和非洲流行率高于美洲、欧洲等。CTX-M是目前世界上流行最多的基因型，例如在美国和欧洲地区，产ESBLs的大肠埃希杆菌(ESBL-EC)中CTX-M型的比例大于90％，肺炎克雷伯菌中阳性率为35％～65.5％，亚洲地区CXT-M型ESBL-EC阳性率为38.2％，肺炎克雷伯中检出率为55.5％。在这种情况下，碳青霉烯类药物由于其对ESBL表现出很高的稳定性，使其成为临床治疗严重革兰氏阴性菌感染的重要药物，然而随着其在临床的广泛的应用，导致其耐药性快速发展和扩散，给人类健康带来巨大威胁。2005年美国纽约市对各医院重症监护室耐药性的调查中发现，35-40％的病人携带耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌，且感染此种细菌的病人在两周内的死亡率高达47％。目前，编码新德里金属β-内酰胺酶(NDM)基因是全球流行范围最广的碳青霉烯耐药基因，该基因在全球范围内呈散发状态，然而在亚洲某些地区阳性率较高，呈地方流行趋势。

目前，实时荧光定量PCR方法在可培养菌及不可培养菌的β-内酰胺类抗生素耐药性的研究中均发挥着重要的作用。目前已有大量关于该研究方法应用的报道，但已报道的方法比较松散，PCR反应条件差异较大，不能在同一PCR反应条件下对样品中多种β-内酰胺类抗生素耐药基因进行检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种8种β-内酰胺类抗生素耐药基因荧光定量PCR检测方法。

本发明提供了引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ、引物对Ⅵ、引物对Ⅶ和引物对Ⅷ组成；

所述引物对Ⅰ由引物NDM-F和引物NDM-R组成；

所述引物NDM-F为如下(a1)或(a2):