[发明专利]一种以草甘膦为筛选剂的胡萝卜遗传转化的方法

权利要求书

1.一种胡萝卜遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；

(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对胡萝卜的外植体进行侵染；

所述侵染的方法如下：将所述胡萝卜的外植体置于农杆菌侵染液中20min；

所述农杆菌侵染液为将所述重组农杆菌悬浮于1/2MS液体培养基得到的；

所述农杆菌侵染液的OD_600nm值为0.5～0.7；

(3)完成步骤(2)后，将所述外植体置于共培养培养基，共培养；所述共培养的条件为25℃暗培养72h；

所述共培养培养基的溶质及其浓度为0.5mg/L 2，4-D、5mg/L AgNO₃、300mg/LTimentin、4.43g/L MS粉末、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，溶剂为水，pH值为5.8-6.0；

(4)完成步骤(3)后，将所述外植体置于诱导培养基，培养，获得愈伤组织；所述培养的条件为25℃光暗交替培养7-10d；

所述诱导培养基的溶质及其浓度为0.5mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、1mg/L草甘膦、5mg/L AgNO₃、300mg/L Timentin、4.43g/L MS粉末、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，溶剂为水，pH值为5.8-6.0；

(5)完成步骤(4)后，将所述愈伤组织依次置于初筛培养基和筛选培养基进行培养，获得胚性愈伤组织；所述培养的条件为23-28℃光暗交替培养7-10d；

所述初筛培养基的溶质及其浓度为0.5mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、5mg/L草甘膦、5mg/L AgNO₃、300mg/L Timentin、4.43g/L MS粉末、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，溶剂为水，pH值为5.8-6.0；

所述筛选培养基的溶质及其浓度为0.5mg/L 2，4-D、0.5mg/L 6-BA、8mg/L草甘膦、5mg/L AgNO₃、300mg/L Timentin、4.43g/L MS粉末、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，溶剂为水，pH值为5.8-6.0；

(6)完成步骤(5)后，将所述胚性愈伤组织置于分化培养基进行培养，获得出芽的胚性愈伤组织；所述培养的条件为25℃光暗交替培养10-30d；

所述分化培养基的溶质及其浓度为5mg/L草甘膦、5mg/L AgNO₃、300mg/L Timentin、4.43g/L MS粉末、30g/L蔗糖和3g/L植物凝胶，溶剂为水，pH值为5.8-6.0；

(7)完成步骤(6)后，将所述出芽的胚性愈伤组织置于生根培养基进行培养，获得胡萝卜转化苗；所述培养的条件为25℃光暗交替培养2-4周；

所述胡萝卜的外植体为胡萝卜下胚轴截成的节段；

所述胡萝卜下胚轴截成的节段的长度为0.5mm±0.1mm；

所述胡萝卜为黑田五寸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：获得所述胡萝卜的下胚轴的方法为：将无菌的胡萝卜种子置于1/2MS固体培养基，23-28℃暗培养6-8d；然后取下胚轴。