[发明专利]携带 SCC/BST2 突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，切除腺相关病毒基因中病毒包装识别位点内全部基因，插入SCC/BST2基因，定点突变，替换CMV启动子，得到pAAV/SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变的重组腺相关病毒载体；其中，突变位点是63位、91位的半胱氨酸和153位、154位酪氨酸，四个位点均突变为丙氨酸；所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的启动子为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子和p5启动子中的一种。

2.一种含有权利要求1所述携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。

3.制备权利要求1所述携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：

1)改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；

2)PCR法得到SCC/BST2抗原的DNA；

3)将步骤2)中SCC/BST2抗原的DNA进行错位PCR，之后和步骤1)产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和SCC/BST2抗原基因的质粒；

4)利用点突变方法，将SCC/BST2基因突变为SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因；

5)将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子，得到重组腺相关病毒载体。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)

中包括以下步骤：

1)从表达SCC/BST2的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；

2)以所述总cDNA为模板，在引物1：

ctggatggcatctacttcgtatgactattgcagagtg和引物2：

gacctttctagatgtgccagcttcctgggatctcactgc的引导下进行PCR扩增，得到的SCC/BST2抗原的DNA。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)

中包括以下步骤

1)利用引物3：gcagtgatggaggatcgcaatgtcacccatctcctg对携带CMV启动子和SCC/BST2抗原基因的质粒进行PCR；

2)利用引物4：caggccgccaccgacaaccacactgtgatggc对1)产物PCR；

3)利用引物5：gtgagaatcgcggacaagaaggccgcccccagctcccaggac对2)产物PCR得到SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因的质粒。

6.一种含有携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于：包括SCC/BST2突变重组腺相关病毒的质粒载体，SCC/BST2突变重组腺相关病毒的病毒载体、被所述SCC/BST2突变重组腺相关病毒的载体感染或转染的细胞系；所述SCC/BST2突变重组腺相关病毒的的质粒载体由权利要求1所述的或者权利要求3～5任一项所述的构建方法制得的携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述SCC突变重组腺相关病毒的病毒载体由所述SCC/BST2突变重组腺相关病毒的质粒载体和重组腺相关病毒包装辅助质粒pAAV-RC2和pAAV-Helper进行细胞培养得到。

7.一种如权利要求1所述的携带SCC/BST2突变重组腺相关病毒的病毒载体或者权利要求2所述的产品在制备治疗SCC/BST2抗原阳性的癌症或癌前病变药物中的应用。