[发明专利]携带 SCC/BST2 突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，将BST2基因插入只保留LTR包装序列的重组腺相关病毒载体中。利用点突变技术突变63和91位半胱氨酸，153和154位酪氨酸突变成丙氨酸。该载体携带SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变基因进入单核‑树突细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应T细胞。实验证明，被这种腺相关病毒感染的树突细胞所诱导的效应T细胞在体外和患者体内均可有效抑制表达SCC/BST2基因的癌细胞，且无致瘤性。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备细胞药物，治疗表达SCC/BST2基因的癌症。

【技术领域】

本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带SCC/BST2突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗SCC阳性的肿瘤药物中的应用。

【背景技术】

鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)是1997年Kato等和Torigoe首先用人宫颈鳞状细胞癌的异种血清，从宫颈鳞状细胞癌组织中提纯的一种抗原TA一4，分子量为42KD -48KD的糖蛋白，而SCC是TA-4的14个亚基之一，属于丝氨酸蛋白酶抑制物(serpin)家族，它并不是由单一的物质组成，至少由2个同源性非常高的基因 SCCAI、SCCA2编码，位于染色体18q21.3相互串联。SCCAI编码产物位于细胞内，呈中性；SCCA2编码产物为酸性，易于释放到细胞外；恶性和正常的鳞状上皮细胞均含中性成分，而酸性成分仅见于恶性细胞。SCC主要存在鳞癌成分的宫颈癌中，对宫颈腺癌的意义较小。以后发现SCC还存在于肺、咽、食管等多部位肿瘤中，特别是鳞状细胞癌。SCC释放到血浆主要取决于肿瘤的浸润性生长和肿瘤的大小。正常鳞状上皮细胞表达SCC，而鳞癌患者因SCCA2编码的酸性产物合成亢进使其在血液的浓度升高。最新研究显示SCC属基因表型标记物是靶细胞基因表达和控制失常的结果，常出现在肿瘤进展阶段，其参与细胞的凋亡调控，表达增加可以使癌细胞通过抑制细胞凋亡途径而对机体的几种细胞自杀机制产生抵抗性，另外还参与细胞外基质的降解、肿瘤的浸润和转移。血清中的SCC浓度和鳞状细胞癌的分化程度有关，正常人血清中SCC浓度<1.5ng /ml；少数良性疾病，如肺部感染、皮肤炎、肾哀和肝病也能见到SCC升高。对于疗效观察和估计预后有实用价值。SCC作为宫颈癌血清肿瘤标志物的临床价值已在大量研究中证实。SCC对早期肿瘤血清学检测意义不大，但可用于监测恶性肿瘤的临床过程，对疾病的好转、发展或复发的判断具有重义。因此， SCC有望成为肿瘤疫苗设计的理想靶抗原。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是：提出一种稳定性高、鳞状上皮细胞癌(SCC/BST2)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus， rAAV)载体及其构建方法与应用。

本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：

本发明提供了一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为SCC/BST2突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。

已知SCC/BST2蛋白通过半胱氨酸Cys/C的二硫键二聚化，之后诱导Tyr/Y 酪氨酸磷酸化活化下游GRB2/ERK/BIM/Cas3等通路，让癌症细胞避免失巢凋亡。本发明通过对该蛋白63位和91位的Cys用PCR法点突变为Ala，消除二聚化能力。同时对153位和154位的Tyr用PCR法点突变为Ala，使之失去磷酸化能力。

已知的腺相关病毒载体具有CMV启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步在SCC/BST2突变重组腺相关病毒中的启动子替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子和p5启动子中的一种。

本发明还提供一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入SCC/BST2突变抗原基因，替换启动子，得到重组腺相关病毒载体。