[发明专利]核酸、重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶及其制备方法

说明书

本发明涉及一种核酸、诱导型重组质粒、转化株、无糖基化乙酰胆碱酯酶及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法。所述核酸为编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白。所述诱导型重组质粒为包含前述编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸。所述转化株为将所述诱导型重组质粒转化于大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞中而得。所述无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法，为利用前述转化株进行液态培养，当液态培养物达到预设菌体浓度时，于液态培养物中加入诱导物，以诱导前述诱导型重组质粒表达乙酰胆碱酯酶，并可经由纯化后得到高活性无糖基化乙酰胆碱酯酶。

【技术领域】

本发明涉及一种核酸、诱导型重组质粒、转化株、乙酰胆碱酯酶以及乙酰胆碱酯酶的制备方法。特别是涉及编码乙酰胆碱酯酶融合蛋白的核酸、适用于大肠杆菌的诱导型重组质粒、生产无糖基化乙酰胆碱酯酶的转化株、无糖基化乙酰胆碱酯酶以及无糖基化乙酰胆碱酯酶的制备方法。

【背景技术】

乙酰胆碱酯酶(Ac etylcholinesteras e；简称为AChE，EC 3.1.1.7)是一种通过水解作用降解神经传导物质-乙酰胆碱使其分解成为胆碱和乙酸的酶。乙酰胆碱酯酶在生物体中经后修饰为糖蛋白，主要位于动物的神经系统突触神经元细胞膜上。乙酰胆碱酯酶的作用为分解乙酰胆碱以终止神经传导，分解后产生的胆碱可以被重新利用合成新的乙酰胆碱分子。然而，当乙酰胆碱酯酶的活性区域与抗胆碱激性物质(包括有机磷剂与氨基甲酸盐类的杀虫剂)结合，则无法分解乙酰胆碱，造成神经传导的紊乱。

由于敏感性家蝇的乙酰胆碱酯酶对于有机磷剂与氨基甲酸盐类农药极为敏感，且其酶活性易于检测，因此农业试验利用萃取自敏感性家蝇脑部的乙酰胆碱酯酶开发一种生化检验法(Chiu et al.,1991)，其可用来检测蔬果有机磷剂及氨基甲酸盐两类杀虫剂残留累计毒性。并自1985年起于产地及市场同步设置快速检测站，建立农药残毒监测工作网。

除了由生物体中直接萃取乙酰胆碱酯酶，近年来因分子生物学及基因工程的进步，亦有许多文献尝试以昆虫细胞、酵母菌、大肠杆菌等不同的宿主细胞表达重组乙酰胆碱酯酶。依据2012年发表的文献数据指出，利用昆虫细胞和酵母菌虽可以成功表达生产重组乙酰胆碱酯酶，但重组乙酰胆碱酯酶的产量不高且酶活性尚可。而以昆虫细胞和酵母菌作为宿主细胞所生产的重组乙酰胆碱酯酶因具有蛋白后修饰作用，与从生物体来源的乙酰胆碱酯酶一样具有糖基化(glyco sylation)。甚至以酵母菌作为宿主细胞所生产的重组乙酰胆碱酯酶因过度糖基化后修饰，而造成重组乙酰胆碱酯酶的活性不佳。另外，先前文献亦有尝试以大肠杆菌作为宿主细胞生产无糖基化(nonglyc o syl ated)乙酰胆碱酯酶(Donget al.,2012)，但前述文献无法得到稳定有活性的乙酰胆碱酯酶。

有鉴于此，本发明的一个目的是提供一种分离的核酸，其序列如S EQ ID NO.1所示，为编码一乙酰胆碱酯酶融合蛋白。

本发明的另一目的是提供一种诱导型重组质粒，包含依序排列的如S EQ ID NO.2所示的诱导型表达组件、如S EQ ID NO.3所示的启动子、如SEQ ID NO.1所示的核酸及如SEQ ID NO.4所示的抗生素抗性基因。

依据前述的诱导型重组质粒，可更包含如SEQ ID NO.5所示的一标签，其连接于如S EQ ID NO.1所示的核酸的3’端。

本发明的又一目的是提供一种转化株，包含宿主细胞和诱导型重组质粒。所述宿主细胞为大肠杆菌(Esch erich ia co li)。所述诱导型重组质粒包含依序排列的如S EQID NO.2所示的诱导型表达组件、如S EQ ID NO.3所示的启动子、如S EQ ID NO.1所示的核酸及如S EQ ID NO.4所示的抗生素抗性基因。

依据前述的转化株，所述大肠杆菌可为氧化态大肠杆菌。较佳地，可为AD494(DE3)菌株或Orig ami(DE3)菌株。