[发明专利]一种丝胶蛋白定量检测方法

权利要求书

1.一种丝胶蛋白定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)筛选丝胶蛋白亲和多肽。

(2)筛选丝胶蛋白最佳结合多肽。

(3)绘制标准曲线，得到丝胶蛋白浓度和吸光度的标准曲线方程为：y＝0.094lgC+0.496，其中，y为吸光度，C为丝胶蛋白浓度。

(4)获得该待检测丝胶蛋白溶液的吸光度，利用步骤3中得到的标准曲线方程就可以得到其对应的浓度。

2.根据权利要求1所述丝胶蛋白定量检测方法，其特征在于，所述步骤1通过以下子步骤来实现：

(1.1)噬菌体消减筛选：将M13噬菌体展示文库用移液器移10μL至24孔板并加入300μL的PBST溶液，然后将其在摇床上以140rpm的速度摇1h；所述PBST溶液由质量含量为99.5％的PBS和质量含量为0.5％的吐温20组成。

(1.2)制备丝胶蛋白薄膜：取300μL浓度为20mg/mL的丝胶蛋白水溶液，滴于24孔板中并室温静置干燥，得丝胶蛋白薄膜，待完全干燥后在丝胶蛋白薄膜上加入300μL的体积含量为90％的乙醇的水溶液，静置十分钟再在孔中加入60μL去离子水，静置30分钟。

(1.3)封闭丝胶蛋白薄膜：除去丝胶蛋白薄膜上的乙醇；并加入400μL的PBST溶液孵育6分钟，除去PBST溶液，从而对丝胶蛋白薄膜上的乙醇进行清洗，重复清洗3次，以充分清洗丝胶蛋白薄膜上的酒精；然后加入400μL封闭液对丝胶蛋白薄膜进行封闭处理，封闭处理需在4℃静置1小时；所述封闭液由质量含量为99.5％的PBS和质量含量为0.5％的BSA组成。

(1.4)丝胶蛋白薄膜和噬菌体的结合：取出步骤1.3封闭好的24孔板，加入400μL的PBST溶液孵育6分钟，除去PBST溶液，从而对丝胶蛋白薄膜上的封闭液进行清洗，重复清洗10次；清洗完成后在丝胶蛋白膜上加入步骤1.1处理后的噬菌体并室温孵育1小时。

(1.5)清洗非特异性结合的噬菌体：取出封闭好的24孔板，加入400μL的PBST溶液孵育6分钟，除去PBST溶液，从而对丝胶蛋白薄膜上不能够进行特异性结合的噬菌体进行清洗，重复清洗10次；接着加入300μL的Glycine-HCl洗脱液，并在室温下静置10min让其充分洗脱，10min后将孔板中的洗脱液全部吸出，装进1.5ml管中并加入45μL的Tris-HCl中和液。对洗脱得到的噬菌体进行浓度测定以确定其浓度。所述Glycine-HCl洗脱液由浓度为0.2M的Glycine水溶液通过HCl调节PH为2.2配置成的。所述Tris-HCl中和液为50mM的Tris水溶液通过HCl调节PH为9.1配置成的。

(1.6)噬菌体的扩增：在装有20ml无菌LB培养液的锥形瓶中加入1ml过夜菌液，将锥形瓶在摇床上摇动20min使细菌菌毛充分伸展。所述过夜菌液由ER2738菌37℃下培养12小时得到。把步骤1.5筛选得到的的噬菌体溶液加到锥形瓶中，然后将锥形瓶静置15min让噬菌体对细菌充分侵染。15min后将已经侵染有噬菌体的细菌培养液在220rpm的摇床上摇4.5h让噬菌体充分进行繁殖，时间到后将锥形瓶取出。

(1.7)噬菌体的第一次纯化：把锥形瓶中的溶液倒进20ml已经进行了灭菌处理的圆底离心管中，配平后把离心管放入离心机中进行离心，离心的速度设置为7000rpm，离心的时间设定为10min。将管中的上清液转移到一个新的圆底离心管中，在其中加入3.3ml的PEG/NaCl溶液，混匀后将溶液放置在4℃的冰箱中让噬菌体过夜沉淀，所述PEG/NaCl溶液是PEG8000和NaCl的水溶液，其中，PEG8000的质量浓度为20％，NaCl的浓度为2.5mol/L。

(1.8)第一次除杂质：24小时后将离心管从冰箱中取出，配平后把离心管在离心机中以12000rpm的速度离心20min。然后弃掉上清液，收集沉淀。用1ml PBS将沉淀再次溶解，接着放入摇床中摇30min。接着取出EP管并配平，以12000rpm的速度在离心机中进行10min的离心，取上清液。

(1.9)噬菌体第二次纯化：把步骤1.8取的上清液用移液器转移到一个1.5ml的EP管中，然后在该EP管中加入0.17ml的PEG/NaCl溶液作为沉淀剂对噬菌体溶液进行再一次的过夜沉淀。

(1.10)第二次除杂质：将过夜沉淀的EP管拿出后配平并在离心机中以12000rpm的速度离心20min。在沉淀剂的作用下，细菌会被离心到EP管的底部，弃掉上清液，加入200μl TBS将沉淀重新溶解并将溶解后的溶液置于140rpm摇床上进行30min的慢摇。随后将EP管放入离心机以12000rpm的转速离心10min，将上清液转移到一个新的EP管中，这个管中的噬菌体溶液即除杂完成的噬菌体溶液。

(1.11)噬菌体的浓度测定：对步骤1.10除杂后的噬菌体进行涂板以测定浓度，并将步骤1.10除杂后的噬菌体加PBS稀释为浓度为10¹¹pfu/ml的溶液并作为新的噬菌体展示文库，按步骤1.1-1.10进行下一轮的筛选，一共进行4轮筛选。

(l.12)对第四轮中步骤1.5洗脱下来的噬菌体进行基因测序，统计不同噬菌体的出现频数，其中，基因序列不同的噬菌体展示不同的多肽。