[发明专利]一种丝胶蛋白定量检测方法

说明书

本发明公开了一种丝胶蛋白定量检测方法，该方法首先筛选丝胶蛋白亲和多肽，然后筛选丝胶蛋白最佳结合多肽，再绘制标准曲线，得到丝胶蛋白浓度和吸光度的标准曲线方程，最后获得该待检测丝胶蛋白溶液的吸光度，利用标准曲线方程就可以得到其对应的浓度。本发明在整个处理过程中具有试剂简便易得，操作步骤成熟，成功率高的特点。通过本发明构建的丝胶蛋白ELISA检测方法扩宽了ELISA检测的应用，让ELISA检测方法可以适用于丝胶蛋白。

技术领域

本发明属于丝胶蛋白的检测技术领域，尤其涉及一种丝胶蛋白定量检测方法。

背景技术

丝胶蛋白作为蚕丝工业中的重要产品，长久以来未能够得到重视。随着研究的进行，丝胶蛋白的应用已经越来越受到人们的关注。现在丝胶蛋白广泛应用于食品、药品、纺织物改性、生物医用材料等多个方面。但对于丝胶蛋白的检测技术却相对发展落后，目前对丝胶蛋白的定量检测只能通过一些蛋白质的检测手段来进行，例如BCA法定量检测、凯氏定氮法定量检测等。但这些方法都有着检测灵敏度低，检测不具有特异性的缺点。

ELISA(酶联免疫吸附测定)作为一种常用的定性和定量检测方法，被广泛应用于各种生化实验之中。它具有检测灵敏度高、特异性强的特点。但要完成ELISA实验，必须购买合适的ELISA抗体。虽然商品化的ELISA抗体种类丰富，但依旧难以满足所有蛋白质的检测，例如本发明中提及的丝胶蛋白就不存在商品化的ELISA抗体，从而无法使用ELISA法检测其浓度。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种丝胶蛋白定量检测方法。

为了实现上述目的，本发明的具体技术方案如下：一种丝胶蛋白定量检测方法，包括以下步骤：

1、丝胶蛋白亲和多肽的筛选，具体为：

1.1噬菌体消减筛选：将M13噬菌体展示文库用移液器移10μL至24孔板并加入300μL的PBST溶液，然后将其在摇床上以140rpm的速度摇1h；所述PBST溶液由质量含量为99.5％的PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)和质量含量为0.5％的吐温20组成。

1.2、制备丝胶蛋白薄膜：取300μL浓度为20mg/mL的丝胶蛋白水溶液，滴于24孔板中并室温静置干燥，得丝胶蛋白薄膜，待完全干燥后在丝胶蛋白薄膜上加入300μL的体积含量为90％的乙醇的水溶液，静置十分钟再在孔中加入60μL去离子水，静置30分钟。

1.3、封闭丝胶蛋白薄膜：除去丝胶蛋白薄膜上的乙醇；并加入400μL的PBST溶液孵育6分钟，除去PBST溶液，从而对丝胶蛋白薄膜上的乙醇进行清洗，重复清洗3次，以充分清洗丝胶蛋白薄膜上的酒精；然后加入400μL封闭液对丝胶蛋白薄膜进行封闭处理，封闭处理需在4℃静置1小时；所述封闭液由质量含量为99.5％的PBS和质量含量为0.5％的BSA(albumin from bovine serum，牛血清白蛋白)组成。

1.4、丝胶蛋白薄膜和噬菌体的结合：取出步骤1.3封闭好的24孔板，加入400μL的PBST溶液孵育6分钟，除去PBST溶液，从而对丝胶蛋白薄膜上的封闭液进行清洗，重复清洗10次；清洗完成后在丝胶蛋白膜上加入步骤1.1处理后的噬菌体并室温孵育1小时。

1.5、洗脱非特异性结合的噬菌体：取出封闭好的24孔板，加入400μL的PBST溶液孵育6分钟，除去PBST溶液，从而对丝胶蛋白薄膜上不能够进行特异性结合的噬菌体进行清洗，重复清洗10次；接着加入300μL的Glycine-HCl洗脱液，并在室温下静置10min让其充分洗脱，10min后将孔板中的洗脱液全部吸出，装进1.5ml管中并加入45μL的Tris-HCl中和液。对洗脱得到的噬菌体进行浓度测定以确定其浓度。所述Glycine-HCl洗脱液由浓度为0.2M的Glycine(甘氨酸)水溶液通过HCl调节PH为2.2配置成的。所述Tris-HCl中和液为50mM的Tris(氨基丁三醇)水溶液通过HCl调节PH为9.1配置成的。