[发明专利]耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种耐药基因mcr‑4/5/8荧光定量PCR检测方法。本发明保护引物组合，由序列表的序列1至序列6所示的单链DNA组成。本发明建立的一种针对这三种mcr基因的基于SYBR染料的荧光定量PCR方法。该检测方法具有快速，灵敏度高，特异性强的技术优点，适用于临床和畜牧养殖业多黏菌素耐药基因mcr‑4/5/8流行状况的监测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，具体一种耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法。

背景技术

多黏菌素被认为是治疗多重耐药阴性菌感染的“最后一道防线”，其耐药率在一段时期内保持在比较低的水平。自2016年，我国首次报道了由质粒介导并可高频率水平转移的多黏菌素耐药基因mcr-1，目前世界上40多个国家和地区相继报道了mcr-1基因，引起了全世界的广泛关注。目前，7种新型黏菌素耐药基因mcr-2～8相继发现。这8种mcr基因均可通过质粒传播，不仅促进了临床上多黏菌素耐药性的发展，也导致多黏菌素耐药性在畜牧业和各种环境中广泛流行。多黏菌素耐药性的快速发展给公共卫生安全和畜牧业发展构成了严重威胁。

然而，传统的检测方法，如常规PCR和Sanger测序，耗时耗力。目前没有针对mcr-4/5/8的荧光定量PCR检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐药基因mcr-4/5/8荧光定量PCR检测方法。

本发明提供了一套引物组合甲，由引物对Ⅰ、引物对Ⅱ和引物对Ⅲ组成；

所述引物对Ⅰ由引物F1和引物R1组成；

所述引物F1为如下(a1)或(a2):

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述R1为如下(a3)或(a4):

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物对Ⅱ由引物F2和引物R2组成；

所述引物F2为如下(b1)或(b2):

(b1)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物R2为如下(b3)或(b4):

(b3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物对Ⅲ由引物F3和引物R3组成；

所述引物F3为如下(c1)或(c2):

(c1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；

(c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物R3为如下(c3)或(c4):

(c3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；

(c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物组合甲的用途为如下(1)或(2)：