[发明专利]绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量方法

说明书

本发明提供一种绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量PCR方法，分别设计一对针对绵羊肺炎支原体特异性检测引物Mo‑F、Mo‑R及一条荧光探针Mo‑P，一条针对丝状支原体山羊亚种的特异性检测引物Mmc‑F、Mmc‑R及一条荧光探针Mmc‑P，并确定了针对绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种的双重应荧光定量PCR方法的特异性引物及应荧光探针的浓度。本发明提供的双重荧光定量PCR方法可以同时检测和鉴别绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种两种支原体，具有快速、准确、特异性强、重复性好等优点，同时还可节约成本，适用于对以上两种支原体所引起的羊支原体性肺炎的快速检测和流行病学调查提供有效手段。

技术领域

本发明涉及绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量PCR方法，属于生物检测技术领域。

背景技术

近年来，我国新疆、辽宁、河北、四川、重庆、广西、贵州、湖南、福建等多个省份流行羊支原体性肺炎，其病原主要是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumonia，Mo)和丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp .capri ,Mmc)。近几年有多位学者报道同一羊群中出现两种以上支原体的混合感染现象,然而这两种病原引起的临床症状相似，病理变化相近,临床上难以区别，给疾病的确诊带来了极大困难。这两种病原是我国当前养羊业的主要疫病，给我国养羊业造成了巨大的经济损失。

绵羊肺炎支原体是羊支原体性肺炎的病原之一，主要临床症状表现为高热、咳嗽、喘气、渐进性消瘦、肺和胸膜发生浆液性和纤维素性炎症, 临床上呈急性或慢性经过，病死率一般为30%～50%, 有的高达80%～100%。绵羊肺炎支原体结构复杂、培养困难，目前仍缺乏有效的生前诊断和防治措施，给养羊业造成巨大经济损失。目前, 该病广泛分布于世界各养羊地区, 尤其是亚洲和非洲国家。

丝状支原体山羊亚种是丝状支原体簇的成员之一，是羊支原体性肺炎的病原之一。可引起山羊以高热、咳嗽渐进性消瘦以及肺实质、小叶间质及胸膜发生浆液性和纤维素性炎症，肺部有明显的肝变为主要特征的呼吸道疾病，此外还可引起乳房炎、角膜结膜炎和败血病等。

目前关于绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种这两种病原的分子生物学诊断方法主要有单一PCR、双重PCR和单一荧光定量PCR方法,尚未见有双重荧光定量PCR同时检测这两种病原的报道。本发明提供快速、特异、灵敏的鉴别或同时检测绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种双重荧光定量PCR方法, 适用于临床快速检测和大规模流行病学调查，有广阔的应用前景，具有重大的经济和社会效益。

发明内容

由于绵羊肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种可同时感染羊，临床诊断难以区分，病原分离鉴定耗费耗力且很难分离Mmc。本发明要解决的技术问题就是针对目前现有的两种病原单一PCR、双重PCR和单一荧光定量PCR检测技术的局限性，提供一种基于应用特异性引物能够快速、准确、同时检测这两种支原体的双重荧光定量PCR方法。

本发明将按以下技术方案解决上述存在问题：

设计检测绵羊肺炎支原体的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mo-F: 5’- CTTCGGGACTTATTGGAG-3’（如SEQ ID No.1所示）；

下游引物Mo-R: 5’-GATGCAAACTGATTTACTTG-3’ （如SEQ ID No.2所示）；

荧光探针Mo-P: 5’-FAM- AAGACCGATTGTCAGGCCGA –Eclipse-3’ （如SEQ ID No.3所示）；

设计检测丝状支原体山羊亚种的特异性引物及探针的序列分别为：

上游引物Mmc-F: 5’- CTAGCTAGCATAGTTGTTG-3’；