[发明专利]一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法

说明书

本发明公开了一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体以及基于该载体的筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法。本发明通过将HTLV‑1病毒LTR区域序列片段克隆到双荧光素酶报告基因载体中，制成一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，可以用于检测CREB信号通路活性，也可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或者抑制剂。同时筛选到靶向调控CREB信号通路的岩藻多糖，岩藻多糖负调控抑制CREB通路激活。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法。

背景技术

CREB(cAMP response element-binding protein，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白)是一种细胞内转录因子，通过结合到环磷酸腺苷反应元件(cAMP response element，CRE)上增强下游基因的表达。CREB信号通路调控着众多生命活动，包括组织发育、记忆形成、昼夜节律等等。CREB信号通路的活性异常将导致癌症、阿尔兹海默症等疾病的发生，并最终可能导致死亡。因此，灵敏可靠地检测CREB信号通路活性，以及人为调控CREB信号通路活性，对于科学研究和临床应用都具有巨大的价值。

HTLV-1(Human T-lymphotropic virus 1，人类T细胞白血病病毒Ⅰ型)是一种C型RNA逆转录病毒，导致全球1500-2000万人感染，从而引发成年人T细胞白血病(ATL)等疾病。HTLV-1基因组的LTR(long terminal repeat，长末端重复)区域有三个CRE，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制。同时，HTLV-1基因组编码Tax蛋白能够激活宿主CREB信号通路以及NF-κB信号通路从而促进病毒自身存活和繁殖。因此，HTLV-1LTR区域是一个灵敏的CREB信号通路响应原件，而Tax蛋白是一个高效的CREB信号通路激活剂。

多糖是一类由碳水化合物组成的高分子生物活性物质。除了直接提供能量，很多多糖因其独特的性质而具有显著的生理功能。已有的研究表面，多糖在增强免疫力、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂的方面都具有理想的功效。海藻多糖是一类藻类特有的碳水化合物，因其与众不同的结构而常常具有一些特殊的生理功能。我国海藻产量丰富，居全球首位，因此也拥有了丰富的海藻多糖资源。充分利用海藻多糖将能够产生巨大的经济和社会价值，发掘海藻多糖的新生理功能具有潜在的科学意义和应用价值。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，通过筛选克隆得到一个HTLV-1病毒LTR区域序列片段，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制，将该LTR区域序列片段构建成一个双荧光素酶报告基因载体系统，可以用于筛选CREB信号通路的激动剂或抑制剂。

一种CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，包括萤火虫荧光素酶报告基因和HTLV-1病毒LTR区域序列片段，所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段位于萤火虫荧光素酶报告基因上游且被CREB蛋白激活后能够启动萤火虫荧光素酶报告基因表达。

所述HTLV-1病毒LTR区域序列片段的序列如SEQ ID No.1所示。该序列从HTLV-1病毒基因组中克隆获得，包含三个CRE，能够与宿主CREB结合而起始转录从而实现自我复制。

所述的CREB信号通路双荧光素酶报告基因载体，序列如SEQ ID No.2所示。该序列包括pGL4.20[Luc2/Puro]质粒(Promega公司)的骨架，含有限制性内切酶BglII和HindIII酶切位点，通过酶切的方法将上述HTLV-1病毒LTR区域序列片段连接到pGL4.20[Luc2/Puro]质粒的BglII和HindIII之间，获得载体命名为pGL4.20-HTLV-1-LTR-2。

本发明还提供了一种筛选CREB信号通路激动剂或抑制剂的方法，包括以下步骤：