[发明专利]一种具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质及其制备方法

说明书

本发明属于生物技术中荧光蛋白质领域，具体的说是涉及一种具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法。利用基因工程方法，将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT，藻蓝蛋白β亚基基因cpcB，血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS导入大肠杆菌，构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径，制备具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。本发明是利用生物技术方法在大肠杆菌体内生产荧光蛋白质，是一种环境友好、成本低的制备方法。该荧光蛋白质可用于荧光检测等领域。

技术领域

本发明属于生物技术中荧光蛋白质领域，具体的说是涉及一种具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法。

背景技术

藻胆蛋白是藻类重要的色素蛋白，具有光能捕获和传递的作用。每分子的藻胆蛋白含有两条结构相似的多肽链α和β，α亚基和β亚基分别含有约160～180个氨基酸残基，二者的比例通常为1:1。亚基中的半胱氨酸残基通过硫醚键与藻胆色素共价结合，藻胆色素的种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定了藻胆蛋白的光谱学性质。根据吸收光谱的不同，可将藻胆蛋白分为4大类：即藻红蛋白PE,λ_max＝540nm～570nm，藻红蓝蛋白PEC，λ_max＝567nm，藻蓝蛋白PC，λ_max＝615nm～640nm和别藻蓝蛋白APC，λ_max＝650nm～655nm。藻胆蛋白具有强烈的荧光特性，已广泛应用于流式细胞分析和免疫荧光检测等领域。

近年来，随着藻胆蛋白生物合成途径的阐明，以及合成生物学技术的发展，在大肠杆菌中人工构建完整藻胆蛋白(含蛋白亚基和色基)的生物合成途径。通过工程菌规模化发酵，实现藻胆蛋白在大肠杆菌中的生物合成与组装，然后通过亲和层析纯化制备重组藻胆蛋白。Tooley等人在国际上率先实现了藻蓝蛋白α亚基(2001年)和藻红蓝蛋白α亚基(2002年)在大肠杆菌中藻胆蛋白的组合生物表达，为藻胆蛋白的制备提供了一条全新的途径。在国内，本专利发明人在藻胆蛋白的组合生物表达，藻胆蛋白的分子进化以及新型人工藻胆蛋白荧光探针分子设计和构建方面，展开了系统性的研究工作，已实现多种藻胆蛋白亚基与多聚体在大肠杆菌中的生物合成与组装，通过蛋白分离纯化技术获得的重组藻胆蛋白，具有与天然藻胆蛋白相似的光谱学性质。此外，通过链霉亲和素和藻胆蛋白的融合表达，获得了同时具有生物素结合能力和荧光特性的融合藻胆蛋白荧光探针分子。

通过基因工程方法获得重组藻胆蛋白，具有快速高效、成本较低、不受季节气候影响等突出优势。但是，目前重组合成的藻胆蛋白荧光蛋白质普遍存在的问题是重组藻胆蛋白只结合一个藻胆色素分子，其斯托克斯位移较小，通常为10-25nm。由于激发光波长和荧光检测波长接近，激发光容易对荧光检测造成干扰。而较大的斯托克斯位移，不仅可以增加荧光检测的信噪比，而且可以降低荧光蛋白质分子的自猝灭作用。本发明提供一种具有大斯托克斯位移的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种大肠杆菌中具有大斯托克斯位移的重组藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法：利用基因工程方法，将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS和cpcT，藻蓝蛋白β亚基基因cpcB，血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS导入大肠杆菌，构建藻蓝蛋白类荧光蛋白质的合成途径，制备具有大斯托克斯位移的重组荧光蛋白质。

具体为：

1)利用基因工程方法，将藻胆蛋白裂合酶基因cpcS插入第一个表达载体中，将藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和藻胆蛋白裂合酶cpcT组成多顺反子插入第二个表达载体的一个表达框中，将血红素氧化酶基因Ho1和藻红胆素还原酶基因pebS组成多顺反子插入到第二个表达载体的另一个表达框中；