[发明专利]基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法

权利要求书

1.一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；

(2)经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作如下：

1)用含有枸椽酸钠的ACD管采外周血7.5ml；

2)将血液转入15ml离心管中，加入约5ml HBSS，重悬血细胞后，缓慢加至含7.5ml淋巴细胞分离液的50ml离心管液面上，1500rpm室温离心18min，吸出中间雾状单个核细胞层；

3)离心期间配红细胞裂解液工作液；

4)加入5ml HBSS，1500rpm离心5min；去上清，加入3ml所述红细胞裂解液工作液重悬细胞，室温避光10min，1500rpm离心5min，去上清；

5)加入5ml HBSS重悬细胞，1500rpm离心5min去上清，加入MACS buffer5ml重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；

6)加入CD326磁珠(20ul/10⁷个细胞)，4℃遮光孵育30min，用MACS Buffer洗涤细胞，1500rpm离心5min，去上清；

7)取LS磁珠分离管安装于磁板上，用3ml MACS buffer润洗分离柱，用500μl MACSbuffer重悬细胞后加入分离柱，等液体全部流出；

8)用3ml MACS buffer涮洗管壁后加入分离柱；

9)加入5ml MACS buffer然后迅速取出分离柱放于流式管上，将分离柱的液体推入所述流式管中，1500rpm离心5min，去上清；

10)加入1ml HBSS后重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；

11)加入三种抗体CK、CD326和CD45，每种10ul，充分混匀，室温避光孵育12min，再加入5ml PBS，1500rpm离心5min去上清，加入500μl PBS上流式细胞仪。