[发明专利]基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法

说明书

本发明提供了一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其包括以下步骤：对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。本发明的方法简单易操作，检测灵敏度高。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法。

背景技术

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。大量研究表明，CTC以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团(CTM，CirculatingTumorMicroemboli)。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(EMT，EpithelialMesenchymalTransition)，故CTC存在不同类型，包括上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮细胞与间质细胞混合表型。CTM和间质细胞表型CTC具有更强的转移潜能。早期发现血液中的CTC，对于患者预后判断、疗效评价和个体化治疗都有着重要的指导作用。CTC检测通过捕捉检测外周血中痕量存在的CTC，监测CTC类型和数量变化的趋势，以便实时监测肿瘤动态、评估治疗效果，实现实时个体治疗。

目前，临床上应用的获得美国FDA和中国药监局批准的唯一的检测循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)的方法是强生公司的仪器(商品名CellSearch)，这是一种使用表皮细胞特异性蛋白作为肿瘤标志物，同时利用免疫磁珠的方法将循环肿瘤细胞富集并最后进行免疫荧光显微观察检测的一种半自动的循环肿瘤细胞计数方法。这种方法存在检测阳性符合率较低的问题。同时由于其系统较为昂贵、单个检测样本成本较高、耗时较长，应用较为困难。因此，临床上迫切需要一种特异性灵敏度高、成本低且操作简单的循环肿瘤细胞检测技术。其他正在申请或已授权专利，还有使用先细胞分离再核酸杂交及荧光显微镜检测的，也都严重依赖操作和耗费人工，比较麻烦。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种特异性灵敏度高、成本低且操作简单的循环肿瘤细胞检测方法。

为了实现以上发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种基于免疫磁珠和流式细胞仪的循环肿瘤细胞检测方法，其包括以下步骤：

(1)对外周血进行穿刺抽血，然后将血液进行重悬血细胞，去掉大部分红细胞，再加入CD326磁珠进行分离；

(2)经过第一次流式细胞仪分选，去掉大部分淋巴细胞，再进行第二次流式细胞仪分选，去掉全部淋巴细胞，最后对剩余细胞进行第三次流式细胞仪分选，即检测出是否存在循环肿瘤细胞。

优选地，步骤(1)的具体操作如下：

1)用含有枸椽酸钠的ACD管采外周血7.5ml；

2)将血液转入15ml离心管中，加入约5ml HBSS，重悬血细胞后，缓慢加至含7.5ml淋巴细胞分离液的50ml离心管液面上，1500rpm室温离心18min，吸出中间雾状单个核细胞层；

3)离心期间配红细胞裂解液工作液；

4)加入5ml HBSS，1500rpm离心5min；去上清，加入3ml所述红细胞裂解液工作液重悬细胞，室温避光10min，1500rpm离心5min，去上清；

5)加入5ml HBSS重悬细胞，1500rpm离心5min去上清，加入MACS buffer5ml重悬细胞，1500rpm离心5min，去上清；