[发明专利]一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下制备步骤：

（1）CD36基因敲除小鼠基因型鉴定：根据The Jackson Laboratory提供的信息，合成CD36基因敲除小鼠鉴定的引物，上游引物为：5’- TTGAAGTGCTGATCCTTTCAGA-3’，下游引物为5’- TGTTTGTTTCACCACACTGGA-3’，下游突变引物为5’- CGCCTTCTTGACGAGTTC-3’，经94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，获得435bp长度的野生型和/或750bp长度的突变型小鼠CD36基因序列；

（2）血小板cDNA的PCR扩增：根据GenBank中编码小鼠CD36的cDNA序列NM_007643.4设计特异性引物，上游引物为5’-AGTGCTCTCCCTTGATTCTG -3’，下游引物为5’-TTTTCCATTCTTGGATTTGCA-3’，经95℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸2min，共32个循环，最后72℃延伸10min，获得1419bp长度的小鼠CD36基因序列；

（3）TA克隆及蓝白斑筛选：CD36基因序列经胶纯化后，参照PcDNA3.1TM/V5-His TOPO®TA Expression Kit操作说明进行TA克隆，并转化TOP10E.coli，经蓝白筛选获得阳性质粒，37℃摇菌16h后，提取质粒DNA进行测序分析；

（4）细胞转染及G418筛选：获得序列与小鼠CD36参考序列一致的质粒DNA后，参照Effectene® Transfection试剂盒的操作说明转染HEK293T细胞，并采用G418进行筛选培养；

（5）流式鉴定：收集小鼠血小板CD36转染的HEK293T细胞，分别与0.05 µg CD36单克隆抗体MCA2748或20ul阳性血清于4℃孵育30min，洗涤两遍后，加入FITC标记的Donkey anti-Rat IgG 抗体，4℃避光孵育30min，洗涤两遍后上流式机分析；

（6） Western Blot鉴定：CD36转染细胞的裂解液经SDS-PAGE电泳后，转PVDF膜，与抗V5肽单克隆抗体反应，然后加入HRP标记Donkey anti-mouseIgG抗体，ECL曝光显影；

（7）CD36基因敲除小鼠免疫：采用0.5X10⁷个小鼠CD36HEK293T转染细胞腹腔免疫CD36-/-小鼠，每周一次，免疫三次后，给与尾静脉转染细胞加强免疫，三天后检测免疫效价并备细胞融合使用；

（8）细胞融合及抗体制备：摘取抗体效价高的已免疫雌鼠CD36-/-的脾脏，将脾细胞与SP2/0-Ag14细胞在PEG作用下进行细胞融合，并采用HAT培养液进行筛选培养；采用流式细胞技术对杂交瘤细胞培养上清进行抗鼠CD36抗体检测，筛选可分泌IgG型抗鼠CD36抗体的杂交瘤细胞，经两次有限稀释培养，获得分泌单抗的杂交瘤细胞株；

（9）抗鼠CD36单克隆抗体鉴定：以流式细胞术进行单抗滴度及特异性分析；并运用Rapid Antibody Isotyping 试剂进行小鼠单抗亚型鉴定；

（10）单抗纯化及蛋白银染鉴定：收集单克隆细胞株的细胞培养上清，并借助Protein G亲和层析柱分离纯化CD36单抗，透析处理后进行SDS-PAGE电泳，经蛋白银染分析单抗的分子量。

2.根据权利要求1所述的一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述的CD36转染HEK293T细胞为2.5 × 10⁵个细胞，Donkey anti-Rat IgG 抗体为1:50稀释，即按体积比：抗体与PBS溶液=1:50。

3.根据权利要求1所述的一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述的CD36转染细胞的裂解液经SDS-PAGE电泳后，转PVDF膜，与抗V5肽单克隆抗体反应体积比为1:2000，即抗体与PBS溶液的体积比=1:2000。