[发明专利]一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明涉及一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，属于基因工程技术领域；具体包括CD36基因敲除小鼠基因型鉴定、血小板cDNA的PCR扩增、TA克隆及蓝白斑筛选、细胞转染及G418筛选、流式鉴定、Western Blot鉴定、CD36基因敲除小鼠免疫、细胞融合及抗体制备、抗鼠CD36单克隆抗体鉴定、单抗纯化及蛋白银染鉴定十个步骤；该方法可获得可稳定分泌鼠源性抗鼠CD36 mAb的杂交瘤细胞株，该mAb可特异性结合小鼠血小板的CD36抗原，与人血小板的CD36抗原无交叉反应，可用于CD36抗体引起的FNAIT小鼠模型的治疗研究，即保证与CD36抗原的特异性结合，又避免异种免疫反应。

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，具体涉及一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，属于基因技术领域。

背景技术

自1989年报道首例CD36抗体引起的血小板输注无效（PTR）患者以来,人们逐渐认识到CD36缺失者（I型）在输血或怀孕过程中有诱导CD36抗体产生的危险，可引起一系列免疫性血小板减少的临床病症，其中包括胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（FNAIT）、血小板输注无效（PTR）和输血后紫癜（PTP）以及TRALI。

CD36是分子量为88kD的跨膜糖蛋白，目前，CD36缺失表达类型主要分为TypeⅠ（血小板和单核细胞均缺失表达）和TypeⅡ（仅血小板缺失表达）两型。据文献报道，CD36缺失频率在日本人群约为3-11%，撒哈拉以南非洲人和美国黑人血小板CD36抗原的缺失频率约为2.4-7.8%，高加索人CD36缺失者极少，低于0.03%。在我国，本研究组对998名中国无偿献血者的CD36抗原表型进行了分析，发现CD36缺失频率约1.8%，且Ⅰ型缺失频率高于0.5%。近几年研究发现，CD36抗体是我国人群发生胎儿/新生儿同种免疫性血小板减少症（Fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia, FNAIT）的重要因素。然而，对于CD36抗体引起的FNAIT作用机制研究尚处于起步阶段。因此，本研究拟利用CD36基因敲除小鼠，通过建立的小鼠CD36转染细胞系免疫方式，制备鼠源性抗鼠CD36单抗，为今后CD36抗体介导FNAIT动物模型建立及作用机制研究奠定工作基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，获得可稳定分泌鼠源性抗鼠CD36 mAb的杂交瘤细胞株，该mAb可特异性结合小鼠血小板的CD36抗原，与人血小板的CD36抗原无交叉反应。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

一种鼠源性抗鼠CD36单克隆抗体的制备方法，包括以下制备步骤：

（1）CD36基因敲除小鼠基因型鉴定：根据The Jackson Laboratory提供的信息，合成CD36基因敲除小鼠鉴定的引物，上游引物为：5’- TTGAAGTGCTGATCCTTTCAGA-3’，下游引物为5’- TGTTTGTTTCACCACACTGGA-3’，下游突变引物为5’- CGCCTTCTTGACGAGTTC-3’，经94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，获得435bp长度的野生型和/或750bp长度的突变型小鼠CD36基因序列；

（2）血小板cDNA的PCR扩增：根据GenBank中编码小鼠CD36的cDNA序列NM_007643.4设计特异性引物，上游引物为5’-AGTGCTCTCCCTTGATTCTG -3’，下游引物为5’-TTTTCCATTCTTGGATTTGCA-3’，经95℃变性30s，54℃退火50s，72℃延伸2min，共32个循环，最后72℃延伸10min，获得1419bp长度的小鼠CD36基因序列；