[发明专利]一种细胞穿膜肽及其制备方法、应用

权利要求书

1.一种细胞穿膜肽，其特征在于：所述细胞穿膜肽包括如下序列：

RRRRRKQARRPRRRRAR。

2.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、提供树脂，且将所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀；

S2、将氨基酸、缩合剂溶于第二溶剂中，形成混合物；

S3、在所述混合物中加入溶胀的树脂以形成反应体系，反应时间为1-4h；

S4、去除反应后所述反应体系中的溶液，对残留物洗涤1-5次，气体鼓动，抽干；

S5、在所述残留物中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；

S6、去除经由步骤S5后的反应体系中的溶液，洗涤1-10次，气体鼓动，抽干，由此获得合成的多肽链；

S7、在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，且洗涤所述滤液；

S8、对经洗涤过的滤液进行萃取，离心得到细胞穿膜肽粗品；

以及S9、对所述细胞穿膜肽粗品进行鉴定和纯化。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述树脂包括Fmoc-Wang树脂。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂；在步骤S1中，所述第一溶剂包括：二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种；在步骤S5中，所述脱帽液包括：二甲基甲酰胺溶液，以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6％W/V的哌嗪和0.1M HOBT；在步骤S7中，所述切割液包括：以重量百分数计，95％的TFA、2％的TIS以及3％的H₂O。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，每种氨基酸与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)；所述缩合剂与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S8中，所述萃取包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)。

8.一种如权利要求1所述的细胞穿膜肽的应用方法，其特征在于，所述细胞穿膜肽用于在C端或N端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。

9.如权利要求8所述的应用方法，其特征在于，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA。

10.如权利要求9任一项所述的应用方法，其特征在于，所述细胞穿膜肽与质粒DNA结合以用于介导质粒DNA的过程包括如下步骤：

S1、将质粒DNA与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；

S2、调整所述质粒DNA与所述细胞穿膜肽两者间的N/P比为0-80；

S3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒DNA和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；

以及S4、4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％FCS的培养基，静置1-4h。