[发明专利]一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法

权利要求书

1.一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

（1）从GenBank数据库中检索沉香倍半萜合酶蛋白质序列（GenBank号：AIT75876.1），并以AIT75876.1序列为目标序列，通过使用非冗余蛋白质数据库进行PSI-BLAST检索，从GenBank数据库中收集蛋白质序列和编码序列，最终纳入68条倍半萜合酶蛋白质序列以及68条对应的编码序列，此序列数据集含68种陆生植物，包括66种被子植物（63种双子叶植物和3种单子叶植物）、苔藓植物和裸子植物；

（2）通过Modeltest 3.7获得最佳模型（GTR + I + G），利用PAUP* 4.0软件计算最优设置参数，运用MrBayes 3.1.2构建倍半萜合酶基因系统发育树；

（3）采用PAML 4.9软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测倍半萜合酶的正选择位点；

（4）利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）进行沉香倍半萜合酶同源建模，PyMOL软件显示正选择位点在沉香倍半萜合酶三维结构上的分布位置，并预测其对酶结构和功能的潜在影响；

（5）运用Discovery Studio中的CHARMM forcefield、Calculate Mutation Energy(Stability)、Electrostatic Potential 和“Build Mutant”模块进行沉香倍半萜合酶突变体的计算分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法，其特征包括步骤（3）和步骤（5）。

3.其中，步骤（3）所述采用PAML 4.9软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测沉香倍半萜合酶的正选择位点，结果显示，247Q，403D，412P，426Y，470G和538S 等6个正选择位点与沉香倍半萜合酶功能位点或保守保守区密切相关。

4.此外，步骤（5）运用Discovery Studio中的CHARMM forcefield, CalculateMutation Energy (Stability), Electrostatic Potential 和“Build Mutant”模块进行沉香倍半萜合酶突变体的计算分析，结果显示，D403R、G470Q和S538K突变后沉香倍半萜合酶自由能降低，这有利于提高沉香倍半萜合酶稳定性；D403R突变的正电静电势表面与周围负电表面抵消而使沉香倍半萜合酶体系能量降低，可能提高沉香倍半萜合酶适应环境的稳定性；G470Q突变能够与底物结合位点451L和454D连接，并通过形成更多的非键相互作用来提高辅酶区域对Mg2+结合稳定性；S538K突变通过与33F和272R形成新的非键相互作用而使沉香倍半萜合酶自由能降低，这提高了酶稳定性并可能增强RRx8W和RXR两个保守区在阻止水分子和其它外部溶剂侵入酶活性中心的作用。