[发明专利]一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法

说明书

本发明公开了一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法，包括如下步骤：1)获得沉香等68条倍半萜合酶相关序列；2)通过Modeltest、PAUP*和MrBayes等软件构建倍半萜合酶系统发育树；3)采用PAML软件的位点模型、枝模型和枝位点模型检测倍半萜合酶的正选择位点；4)对沉香倍半萜合酶进行同源建模，通过PyMOL软件显示正选择位点；5)运用Discovery Studio软件进行沉香倍半萜合酶突变体的计算分析。结果表明，247Q、403D、412P、426Y、470G和538S等6个正选择位点与沉香倍半萜合酶功能位点或功能保守区密切相关；D403R、G470Q和S538K突变后有利于提高沉香倍半萜合酶活性与稳定性。本发明方法基于计算生物学，操作简单，能够实现经济快捷筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点。

技术领域

本发明涉及一种基于计算生物学筛选提高沉香倍半萜合酶活性的关键氨基酸位点的方法。

背景技术

沉香是传统的名贵中药，印度尼西亚、马来西亚和越南是沉香的主要出口国。在中国，沉香主要分布在海南、广东等省。沉香具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘等功效，主要用于治疗风湿病和咳嗽。此外，沉香还广泛应用于天然香料、精油等。高品质沉香价格可达每千克1000美元，具有巨大的商业价值，被誉为“植物中的钻石”，市场需求量很大。而沉香是在沉香属植物受到自然或人为伤害后形成，自然条件下沉香结香非常缓慢。因此，沉香的供应量远远不能满足市场需求，迫切需要发现一种提高沉香产量的新方法。

白木香(Aquilaria sinensis (Lour.) Spreng)为瑞香科沉香属植物，是生产芳香类药材国产沉香的主要资源植物和正品来源。倍半萜是沉香的主要药效成分，是白木香适应环境而产生的次生代谢产物。沉香倍半萜合酶（Aquilaria sinensis Sesquiterpenesynthase）是沉香生物合成的关键酶，其活性高低直接影响沉香的结香量。然而，天然的倍半萜合酶活性很低，成为制约代谢工程量产倍半萜的关键技术瓶颈。研究表明，基于适应性进化理论对蛋白质进行正选择位点分析，为深化阐明蛋白质活性位点与功能的相互关系，改良酶的活性提供了重要的信息。

正选择也指达尔文选择或定向选择，即把具有提高个体适合度的有利突变等位基因在某个群体中固定下来的选择作用，以适应不同的生存环境。正选择作用在适应性进化机制中处于核心地位，当群体中出现能够提高个体生存力及繁衍力的突变时，具有该基因型的个体较其它个体将更可能存活并遗留更多子代，导致突变基因型最终得以在整个群体中扩散和固定。而基因水平的适应性进化的一种重要方式是指基因通过正选择得到积累并保持有利突变，改变蛋白结构和功能，进而适应外界变化。正选择表现在蛋白质氨基酸序列上，其非同义置换率(dN)高于同义置换率(dS)。适应性正选择的研究既有助于对基因功能区的预测，为解决某些生物技术和生物医学难题提供了崭新的思路。

植物在长期的生物进化过程中，为了提高适应环境的生存能力，会产生一些对生态环境高度适应的次生代谢物质，这些次生代谢物质具有自身防御和繁衍后代的重要功能。植物进化学家已在陆生植物中陆续发现了适应性进化的正选择作用，研究发现的正选择作用主要集中在与抗逆及生殖相关的基因。2008年美国科学家Howitz K T和Sinclair DA在《Cell》提出了Xenohormesis效应假说，从进化与生态角度解释了由植物产生的次生代谢产物可使异养生物受益，增加其生存机会的原因。Xenohormesis效应假说也为从进化和生态角度理解植物类中药次生代谢产物的生物效应提供了理论支持。