[发明专利]一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法

权利要求书

1.一种用于生产AFG1的培养基，其特征在于，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；

其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每195g-205g土豆加入495-505mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入15-25g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；

所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉975-985g，鸡蛋175-185g，酵母粉10-20g，蛋白胨30-40g，蔗糖180-190g，玉米浆575-585g，氯化钠3-7g，花生饼粉75-85g，水575-585g；

所述二级培养基的制备包括如下步骤：

S1、成分一的制备：将975-985g玉米粉、175-185g鸡蛋、5-10g蔗糖和10-20g酵母粉加水搅拌均匀，室温静置2小时，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；

S2、成分二的制备：将30-40g蛋白胨，175-180g蔗糖，575-585g玉米浆，3-7g氯化钠，75-85g花生饼粉搅拌均匀，再加适量水搅成馅状，分装入5个500mL烧杯中，用8层纱布包扎；成分一和成分二在121℃高压灭菌25min；

S3、灭菌结束后，在灭菌温度降低到80℃时，直接转移至超净工作台，将成分一和成分二进行一一对应，放入研磨仪打碎，搅匀后重新转移至烧杯中。

2.一种利用权利要求1所述培养基制备AFG1标准品的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、一级培养：取冰箱4℃保藏的菌种3.6156在超净台接种到PDA液体培养基，培养温度28℃，转速180转/分钟摇床培养2天；

b、将步骤a培养好的菌种超净台全部接种到步骤S3的烧杯中，无菌搅拌均匀，转移至洁净一次性密封袋，每100g一袋，袋口不封；温箱中26℃培养3天，升高温度到33℃继续培养6天，袋口封死四分之三，保持温箱湿度在80％左右；

c、将步骤b样品袋放置大烧杯里，在121℃灭菌30min，灭活存活菌种；

d、在步骤c烧杯中加入甲醇没过样品袋，样品袋用尖刀扎口使甲醇能进入，烧杯封口，摇床振荡提取30分钟,用两层纱布过滤收集溶液后，10 000转/分4℃离心10分钟，收集上清液1；重复以上操作一次，收集上清液2，备用；

e、将步骤d中的上清液1减压浓缩，添加三种QuEChERS净化粉，包括C18粉、氨丙基粉和氧化钙粉，振荡5分钟，离心后将上清液过0.22μm的有机滤膜；

f、将步骤e溶液移入洁净试管，30℃氮气吹干，收集底部结晶；

g、将步骤f结晶转移至洁净试管，用1ml甲醇复溶，加入5ml己烷重新结晶；

h、收集结晶，经液相色谱质谱检测含量。

3.如利用权利要求2所述的制备AFG1标准品的方法，其特征在于，步骤d中，上清液2用于再次实验时第一次提取。

4.如利用权利要求2所述的制备AFG1标准品的方法，其特征在于，步骤e中，C18粉0.2g，用于吸附蛋白和脂类；氨丙基粉0.1g，用于吸附色素；氧化钙粉2g，用于吸水。