[发明专利]一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法

说明书

本发明提出了一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；本发明通过变温培养提高了次级代谢产物真菌毒素的产量；原料易得，生产成本低，工艺操作更安全；通过密封袋的引入，模拟了自然微氧潮湿条件，提高了毒素的转化率，减少了转接过程污染风险；提取方法简单；溶剂回收利用成本迪；通过氮气吹干AFG1结晶，加己烷重结晶纯度提高到99％以上。

技术领域

本发明涉及生物制备技术领域，尤其是涉及一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法。

背景技术

黄曲霉毒素污染是农作物、食品和饲料中主要的质量安全问题之一，是全世界共同关注和需要攻克的难题，因此对于黄曲霉毒素标准物质的需求十分广泛。其中，AFG1被认为是一种致癌力最强的天然物质。世界各国都制定了严格的限量标准，然而黄曲霉毒素产生条件受地域、气候、种植作物、储存条件等一系列因素的影响，其特性使防控成为世界性的难题。黄曲霉毒素属于霉菌次级代谢产物，不是其繁殖必须的代谢物，产量少，基质复杂，培养和提取纯化有较高的工艺要求，造成其价格昂贵。

我国对真菌毒素的研究自上世纪80年代，起步较晚，随着检测技术的发展和食品安全意识的不断提高，我国政府监管部门高度重视真菌毒素防控工作，于2016年6月在北京召开了第一届中国真菌毒素大会，并由中国农业科学院农产品加工研究所在北京牵头成立了国家真菌毒素防控科技创新联盟。联盟主题是“合作研究、联合攻关、成果共享”构建长效合作机制，为农产品质量安全真菌毒素防控科技交流提供开放的平台。虽然我国的检测技术和设备与国外相比，已没有差距，但在黄曲霉毒素标准物质的研制和生产方面尚未起步。目前，黄曲霉毒素标准物质的生产和研制被国外大型生物公司垄断，我国使用的黄曲霉毒素标准品主要依靠进口，国外比较知名的公司有德国的SIGMA公司、美国的ROMER公司，美国的ALEXIS公司，奥地利的Biopure公司，新加坡的Pribolab公司，以及以色列的FERMENTEK公司。

目前，在黄曲霉毒素标准物质的研制方法检索到文献两篇，刘综河在1983年报道，通过大米培养基可以生产AFG1，其工艺简单，用氯仿或石油醚提取，柱层析纯化，但污染大，产量低，培养基配方原始，没有商业价值。另外，专利号2015102106062为一种黄曲霉毒素B1的制备方法，利用花生壳、花生渣和蔗糖等培养基制备黄曲霉毒素，通过乙酸乙酯提取，基质复杂，真菌毒素生长缓慢，干扰因素和固体废弃物较多，提取方式单一，制约商品化生产。

发明内容

本发明提出一种用于生产AFG1的培养基及其制备AFG1标准品的方法，工艺简便，生产成本低，过程安全可控，收率高，特别适于商品化生产。

本发明的一种技术方案是这样实现的：

AFG1主要结构为二氢呋喃环和香豆素，分子式为C₁₇H₁₂O₇，难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH9-10的强碱溶液中分解迅速，其纯品为无色结晶，耐高温，熔点为244-246℃，结构式如下：

一种用于生产AFG1的培养基，包括一级PDA液体培养基和二级培养基；

其中，所述一级PDA液体培养基的制备包括如下步骤：将土豆削皮切丁，每195g-205g土豆加入495-505mL的水，煮沸30min；双层纱布过滤至烧杯中，加入15-25g蔗糖，加水至1L，每50mL溶液分装入250mL三角瓶，121℃高压灭菌20min；

所述二级培养基的成份按照重量份包括：玉米粉975-985g，鸡蛋175-185g，酵母粉10-20g，蛋白胨30-40g，蔗糖180-190g，玉米浆575-585g，氯化钠3-7g，花生饼粉75-85g，水575-585g；

所述二级培养基的制备包括如下步骤：