[发明专利]一种检测苔藓虫在污损早期附着程度的方法

权利要求书

1.一种检测苔藓虫幼虫早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：

(1)苔藓虫特异性引物的设计

(2)污损早期，海水污损样本的采集和基因组的提取。

(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着情况。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：苔藓虫特异性引物设计方法如下：

比较主要海洋污损生物的18S核糖体基因序列，找出苔藓虫的特异性单核苷酸多态性位点。该位点作为引物的3’最末端位置使用。引物的3’倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之间没有错配或形成一个错配(弱错配:A-C,T-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)，与非靶序列也形成一个错配(强错配:T-T,T-C,A-G；或者是中等强度的错配:A-A,C-C,G-G)。这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3’倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果，而与非靶序列有两个3’最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得苔藓虫特异性引物。

3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所设计的三对苔藓虫特异性引物分别为：

Bug1F CGGCACGAACACTGTTATGACA

Bug1R GGCATCACAGACCTGTTATTGC

Bug2F TTAATTCCGATAACGAACGAGTTT

Bug2R GGCATCACAGACCTGTTATTGC

Bug3F TCGTACACGTTTTGTTGGTGCT

Bug3R CCCGTGTTGAGTCAAATTAAGC

上述引物或上述引物之一与若干18S rDNA通用引物一起使用可以完成早期污损样品中苔藓虫存在与否的测定判断。其中特异性引物Bug1在唇口目(Cheilostomatida)覆盖率较大，特异性引物Bug2是新唇口亚目(Neocheilastomina)特异性引物，特异性引物Bug3是网纱帐苔虫(Conopeum reticulum)的种特异性引物。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将设计筛选出的3对苔藓虫特异性引物应用到污损早期不同涂层表面的生物群落，依据PCR或qPCR扩增结果及对应引物信息从而定量检测苔藓虫的附着程度。