[发明专利]一种检测苔藓虫在污损早期附着程度的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测苔藓虫在海洋污损中早期附着程度的方法，该方法包含以下步骤：(1)苔藓虫特异性引物的设计；(2)污损早期不同涂层表面海水污损样本的采集和基因组提取；(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来定量检测苔藓虫的附着程度。本发明基于海洋污损真核生物苔藓虫的18S核糖体RNA基因序列设计特异性引物，提供了一种不依赖于纯培养体系的苔藓虫附着测定方法，为海水现场污损样本中苔藓虫的附着程度检测提供了高效、快速的技术手段。同时，该方法也适用于室内纯培养体系中不同涂层表面的苔藓虫附着测定。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及在主要的海洋污损生物中对污损早期苔藓虫附着的测定。

背景技术

苔藓虫、牡蛎等多种附着海洋生物，它们的幼虫或孢子吸附在轮船底部或海洋结构物表面，吸附生长厚度有时可达10公分，给行船额外带来大量能耗，同时释放酸性物质腐蚀船底，这就是海洋生物污损。海洋生物污损给全世界海洋产业的发展带来严重危害，极大程度上限制了人类对于海洋资源的开发和利用，海洋防污成为亟待解决的重要问题。

主要的海洋污损生物(macrofouler)是苔藓虫、藤壶、牡蛎、盘管虫、海鞘、某些藻类、贻贝、海绵等。作为海洋污损生物的代表物种之一，苔藓虫属真体腔动物，是海洋底栖动物的重要组成之一，种类多，分布广，常常形成群体，密布在岩壁、鱼网、船底、浮标等物体上，在海洋污损生物中的出现频率很大。

尽管国内外已有许多有关海洋防污技术的研究，但是这些发现很多尚没有针对主要的海洋污损生物进行实际的长期的海水实验。相关的防污机制研究、尤其是在分子水平上的深入研究，相对还是非常缺乏。而在世界不同海域不同的船舶所遇到的生物污损问题和程度不尽相同，尤其是污损生物种类繁多，各自附着的分子机制有所不同，很难使用一种或几种防污涂料就能解决所有问题。将来可能陆续需要研制分别针对不同污损生物附着的防污涂层以及组合防污涂层。所以，在细胞和分子生物学水平上对污损生物进行足够的研究就显得非常重要，否则，尽快找到通用的环保型防污技术的可能性将会大大降低。

而要完成上述研究任务，一个非常必要的先期任务是建立主要污损生物幼虫在早期污损期间附着程度的定量测定方法。而想要对苔藓虫早期附着时进行测试其附着率，分子标记方法成为首选的技术手段。该方法能够避开生物形态结构差异的干扰，直接通过检测生物体内大分子包含的稳定遗传信息，定量描述、分析附着情况，在相当程度上提高了鉴定主要海洋污损早期生物物种的准确度和效率。

苔藓虫的附着程度检测至少在如下几个方面非常重要:(1)快速比较一批防污涂层在海洋污损早期抑制苔藓虫附着能力的差异；(2)比较某个涂层在室内苔藓虫纯培养体系中幼虫附着率与实际海水中幼虫附着率的差异。(3)优质涂层抑制海洋污损的机制研究：有时需要测定在某个特定的涂层表面苔藓虫的附着生长被抑制是由于幼虫附着被抑制还是附着后生长被抑制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在海洋污损中对污损早期苔藓虫附着程度进行测定的方法。测定的特异性是由三对苔藓虫特异性引物来保障的，三对特异性引物均基于苔藓虫的18s rDNA设计。它们与核糖体模因18s rDNA的通用引物一起使用可以确保苔藓虫基因扩增的特异性。扩增结果可以通过 qPCR或一般PCR结束后的凝胶扫描来实现定量测定。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

(1)苔藓虫特异性引物的设计；

(2)污损早期(肉眼可见附着之前)海水污损样本的采集和基因组提取；

(3)利用苔藓虫特异性引物对上述基因组样本进行PCR扩增来测定苔藓虫的附着程度。