[发明专利]Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

权利要求书

1.一种建立Sqstm1基因敲除小鼠模型的方法，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立Sqstm1基因敲除小鼠模型，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤一、确定Sqstm1小鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3，sgRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；

步骤二、将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Sqstm1基因敲除小鼠；

所述RNA1如SEQ ID NO:2所示，所述sgRNA 2如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA3如SEQ IDNO:4所示，所述sgRNA4如SEQ ID NO:5所示。

2.根据权利要求1所述建立Sqstm1基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述的方法中步骤二为以下步骤：

(1)、小鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；

(2)、将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射到小鼠受精卵中；

(3)、受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

3.根据权利要求1-2任一所述建立Sqstm1基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)、确定Sqstm1基因待敲除的靶点，并将sgRNA与Cas9核酸酶mRNA体外转录；

(2)、小鼠促排卵、体外受精，受精卵显微注射；

(3)、取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

(4)、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

(5)、将阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

(6)、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

4.根据权利要求1-2任一所述建立Sqstm1基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤三，步骤三为：鉴定Sqstm1基因敲除小鼠动物模型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤三具体为：

(1)、取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

(2)、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

(3)、将阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

(4)、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

6.根据权利要求1-2任一所述的方法在肿瘤研究中的应用。

7.根据权利要求1-2任一所述的方法获得的小鼠动物模型的敲除Sqstm1基因的细胞。

8.一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Sqstm1基因敲除小鼠模型的sgRNA，其特征在于，包括sgRNA1-4，所述sgRNA1如SEQ ID NO:2所示，所述sgRNA 2如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA3如SEQ ID NO:4所示，所述sgRNA4如SEQ ID NO:5所示。

9.权利要求8所述的sgRNA在建立基因缺陷小鼠中的应用。