[发明专利]Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

说明书

发明公开了一种Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用，所述小鼠动物模型是敲除Sqstm1基因的小鼠。本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Sqstm1基因敲除小鼠模型，其构建方法包括如下步骤：步骤一、设计sgRNA和Cas9 RNA并体外转录成mRNA，将有活性的sgRNA和Cas9 RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Sqstm1基因敲除小鼠；步骤二、对Sqstm1基因敲除小鼠动物模型的鉴定。本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除技术首次构建了Sqstm1基因敲除的小鼠动物模型，为研究Sqstm1与自噬、肿瘤等疾病的关系提供便捷、可靠、经济的动物模型。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种Sqstm1全基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。

背景技术

Sqstm1基因，全称Sequestosome 1，又称为p62；A170；DMRV基因等，该基因位于5号染色体q35，Sqstm1分子质量为62kD，以散在点状或者聚集形式存在于胞浆中，它由440个氨基酸编码而成，包含PBl域、TB域、UBA域、LIR域等功能域。这些功能域的存在，使Sqstm1成为多个信号通路核心，Sqstm1功能异常会导致多种信号通路的受阻、蛋白异常聚集进而诱发多种疾病的发生。

Sqstm1曾被认定为是酪氨酸磷酸化的独立配体，随着研究的深入，越来越多的证据表明Sqstm1在选择性自噬中具有重要的影响作用。Sqstm1参与自噬调节维持细胞内稳态以及信号转导。Sqstm1与自噬的关系具有双向性，一方面细胞内Sqstm1水平严格受自噬活性的调控，另一方面Sqstm1也能通过激活靶蛋白复合物信号通路负性调节细胞的自噬活性。最新的研究发现，Sqstm1的水平与多种肿瘤的进展密切相关，在肺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、食管癌、肝癌等多种肿瘤中高表达，并且与肿瘤组织的恶性病理特征密切相关。但有关Sqstm1基因功能研究目前还缺乏转基因和(或)基因敲除动物模型。

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。

由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点，近年来CRISPR/Cas9技术获得了快速发展。使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除需要两个关键因素，首先是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(ZFN)技术和类转录样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。因此本研究通过CRISPR/Cas9技术通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和sgRNA构建稳定敲除Sqstm1基因小鼠模型，为进一步研究Sqstm1与自噬、肿瘤等疾病的关系提供了良好的基础。

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发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种建立Sqstm1基因敲除小鼠模型的方法。

本发明的第二个目的是，提供一种建立Sqstm1基因敲除小鼠模型的方法的应用。