[发明专利]一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用。羰基还原酶突变体基因，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的羰基还原酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一种生产羰基还原酶的基因工程菌，其中包含本发明所述的羰基还原酶基因。一种羰基还原酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明生产羰基还原酶的基因工程菌，获得重组表达的羰基还原酶。以该重组表达制备的羰基还原酶为催化剂，不对称还原羰基类化合物制备光学活性手性醇，实现重组羰基还原酶的制备，并将其用于不对称催化合成(R)‑2‑羟基‑4‑苯基丁酸乙酯。底物转化率达96.8％，还原产物的ee大于99％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种羰基还原酶突变体及其编码基因和应用。

背景技术

阿托伐他汀钙商品名立普妥(lipitor)，是重要的降胆固醇类药物。其(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(分子式为C(CH3)3OCOCH2CH(OH)CH2CH(OH)CH2CN)，带有两个具有手性结构的羟基，是合成阿托伐他汀钙的关键手性中间体，它具有能够强效抑制羟甲基戊二酰单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性，阻断HMG-CoA还原成羟甲戊酸的关键结合部位，能够大幅度的降低胆固醇，可有效改善动脉粥样硬化。阿托伐他汀钙的关键手性中间体其合成方法有多种，常见的方法主要有化学法和酶法，与化学法相比，酶法具有反应条件温和、常温、常压、副反应少、成本低、设备要求低，且反应转化效率高等多种优点，获得了企业的广泛青睐，具有很好的工业应用前景。

发明内容

本发明提供了一种解决酶催化效率低，反应后处理难的问题，提供一种具有催化效率高、后处理容易的重组羰基还原酶，以及含有该羰基还原酶基因的重组表达载体和基因工程菌，以及其重组酶的制备方法，以及利用该重组酶不对称催化制备光学活性手性醇，特别是催化合成阿托伐他汀钙药物重要手性中间体((3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种羰基还原酶突变体基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其野生型基因序列来自假丝酵母Candida magnoliaeADH3(GenBank:ABB91667.1)，经过致突变PCR方法对其进行突变得到。

本发明所述的羰基还原酶基因编码的羰基还原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有本发明所述的羰基还原酶突变体基因的重组表达载体。其可通过DNA重组技术将羰基还原酶基因的核苷酸序列连接于到各种表达载体(pET、pGEX系列)上构建而成，更优选地选自pET系列。本发明的一个实施例中所使用的质粒为pET-24a。

一种生产权利要求2所述的羰基还原酶突变体的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本发明所述的羰基还原酶突变体基因。

所述基因工程菌的宿主细胞优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。

本发明构建羰基还原酶突变体基因工程菌的方法包括羰基还原酶突变体文库的建立；将突变体文库进行酶切；将经酶切后的文库连接插入到载体中；构建表达载体；通过高通量筛选获得酶活较高的重组基因工程菌。

一种所述的羰基还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的基因工程菌，获得重组表达的羰基还原酶。

本发明所述的制备方法，其发酵罐培养的发酵条件优选：溶氧35-45％，空气流量1:1.5vvm。本发明所述的羰基还原酶突变体在催化制备手性醇中的应用，以所述的羰基还原酶为催化剂不对称还原羰基类化合物制备光学活性手性醇；优选以所述的羰基还原酶为催化剂催化还原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯。

有益效果：