[发明专利]人源化GITR基因改造动物模型的制备方法及应用

权利要求书

1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括人GITR基因的1号外显子的起始密码子至4号外显子，所述的方法包括将动物来源的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和4号外显子的部分核苷酸序列替换为人GITR基因的第1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部和4号外显子的部分核苷酸序列，所述的人GITR基因的第1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部和4号外显子的部分核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示，该人源化动物模型体内表达人源化GITR蛋白，所述人源化GITR蛋白包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，胞内参与信号传导的区域和跨膜区为动物来源，胞外区来源于人，所述的人源化GITR蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：27所示，同时内源GITR的蛋白表达降低或缺失。

2.根据权利要求1所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码人源化GITR蛋白，所述人源化GITR蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中所述嵌合GITR基因编码胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述嵌合GITR基因编码的胞外区域包含人GITR蛋白胞外域的全部或部分片段，同时该动物来源部分和人GITR基因部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Gitr启动子后，所述嵌合GITR基因的跨膜区为动物来源。

3.根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物来源部分包括Gitr基因的4号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行GITR人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。

5.根据权利要求4所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物来源的Gitr基因为啮齿类动物来源的Gitr基因，所述啮齿类动物为小鼠。

6.根据权利要求5所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Gitr的第1号外显子、2号外显子、3号外显子和4号外显子的部分序列替换为人GITR基因的第1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部和4号外显子的部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-7任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：8-14任一项所示。

7.根据权利要求1所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包括嵌合GITR基因，所述嵌合GITR基因编码权利要求1所述的人源化GITR蛋白，或所述的嵌合GITR基因选自下列组中的一种：

a）嵌合GITR基因为SEQ ID NO：24所示的序列；

b）嵌合GITR基因的CDS序列为SEQ ID NO：25所示的序列；

c）嵌合GITR基因的mRNA序列为SEQ ID NO：26所示的序列；

或

d）嵌合GITR基因中来源于人GITR基因的部分为SEQ ID NO：30所示的序列。

8.一种靶向载体，其包含：a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90%同源性的核苷酸；b）插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000070.6至少具有90%同源性的核苷酸，所述的替换的供体DNA序列包括人GITR基因的第1外显子的起始密码子至第4外显子，所述人GITR基因的第1外显子的起始密码子至第4外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示，所述5’臂序列如SEQ ID NO：28所示，所述3’臂序列如SEQ ID NO：29所示。