[发明专利]一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用

说明书

本发明公开了一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用，多肽制备方法为：1、六棱菊种子酶解，酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液浓缩、冻干，得多肽冻干粉；2、用DA201‑C型大孔树脂对多肽冻干粉初步分离纯化，依次用30％、45％、60％、75％乙醇梯度洗脱，各梯度洗脱4BV，收集各梯度洗脱液，浓缩、冷冻干燥得F30、F60、F75粗品；3、凝胶过滤色谱纯化：根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的流份，冷冻干燥，分别得多肽F30、F60、F75。本发明多肽可显著提高骨髓间充质干细胞增殖率，可用于骨髓间充质干细胞快速扩增。

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已成为21世纪生命科学研究的重点，它是一类由Friedenstein等最先发现的成纤维样细胞，能够自我增殖和多向分化。BMSCs是一个有广阔前景的研究领域，有望被用在细胞疗法治疗中，这些都归功于其特殊能力，包括自身增殖能力强、分化范围广，能够修复损伤的功能组织及免疫调节等功能，不像人类胚胎干细胞一样涉及伦理道德方面的问题。此外，因为它们具有归巢性，所以可能作为运载工具定向运送生物制剂来治疗某些疾病。目前，BMSCs已在动物实验和临床应用中取得了巨大的成果，包括骨或软骨损伤、心脏疾病、中枢神经系统损伤、肝损伤、脊髓损伤等方面都有突破。

因为BMSCs在基础研究及临床应用方面均具有巨大潜能，所以对于其培养增殖仍然需要更进一步研究，以便可以更为高效地获取利用这种细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多肽及在促进骨髓间充质干细胞增殖方面的应用。

本发明通过如下技术方案实现：

技术方案一：

一种促进骨髓间充质干细胞增殖的多肽，通过如下步骤制备而成：

步骤1、六棱菊种子多肽冻干粉的制备

六棱菊种子经碱性蛋白酶Alcalase2.4L+胰蛋白酶在复合配比3:1、pH为7.4、温度60℃、底物质量浓度40g/L、加酶量6％、酶解时间6h的条件下酶解，酶解结束后升温至90℃保持适当时间进行灭酶处理得六棱菊种子蛋白酶解溶液。将酶解液装入截留分子量为7000Da的透析袋中透析，将含有分子量小于7000Da的透析袋外部水溶液减压浓缩，然后将浓缩的多肽溶液于冷冻干燥机中冻干，即得六棱菊种子多肽冻干粉。

步骤2、大孔树脂初步分离纯化

采用DA201-C型大孔树脂对多肽冻干粉按疏水性进行初步分离纯化：

(1)先将树脂用无水乙醇浸泡24h，然后用无水乙醇洗至220nm无吸收，再用去离子水洗净后备用；常温下将浓度为50mg/mL的多肽冻干粉水溶液以0.5BV/h的流速流经层析柱，用紫外检测器检测流出液的吸光值A220，以A220＝0.05为穿透点；

(2)上样结束后，用去离子水以1BV/h的流速冲洗层析柱，分管收集洗脱液，测定水的电导率，当电导率降至与去离子水相当时，采用30％的乙醇对吸附在大孔吸附树脂上的多肽冻干粉洗脱4BV，收集洗脱液，45℃真空旋蒸浓缩至无醇味，冷冻干燥得F30粗品。

步骤3、凝胶过滤色谱纯化

将F30粗品配成浓度为50mg/mL的样品溶液，采用柱尺寸为1.6×100cm的SephadexG-15凝胶滤过色谱再进行进一步分离纯化，上样量1mL，洗脱液为去离子水，流速为15mL/h，检测波长220nm，根据色谱图收集样品溶液中吸光度最高的色谱峰对应的洗脱流份，冷冻干燥，得到多肽F30。