[发明专利]重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化

权利要求书

1.一种对胰蛋白酶进行固定化的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1) 基于SEQ ID NO: 1所示的野生型胰蛋白酶，在其羧基端加上Cys，第99位Arg突变为His，获得胰蛋白酶；

(2) 将步骤(1)获得的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂、三(2-羧乙基)膦混合；胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂的质量比为1～5:1，胰蛋白酶与三(2-羧乙基)膦的质量比(5～50):1，温度25～38℃，反应时间20～50小时；所述的胰蛋白酶抑制剂为抑肽酶；

(3) 以活化凝胶为固定化载体，将步骤(2)的混合液与之混合，进行固定化反应，反应时溶液的pH值为7.0至8.0；

(4) 将经固定化反应的产物在酸性条件下处理，解除胰蛋白酶抑制剂的抑制作用，获得固定化的活性胰蛋白酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，胰蛋白酶与三(2-羧乙基)膦的质量比为(10～20):1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化凝胶为活化的琼脂糖凝胶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为环氧活化或碘乙酸活化的琼脂糖凝胶。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，溶液的pH值为7.5±0.2。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，温度为25～35℃。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，反应时间为25～40小时。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，固定化反应时，反应时间为30～35小时。

9. 一种固定化胰蛋白酶制剂，其特征在于，所述的固定化胰蛋白酶制剂包括：活化凝胶以及与之偶联的胰蛋白酶；所述胰蛋白酶基于SEQ ID NO: 1所示的野生型胰蛋白酶、羧基端加上Cys且第99位Arg突变为His，该Cys的巯基与活化凝胶的活化基团偶联；所述的固定化胰蛋白酶制剂由权利要求1～8任一所述的方法制备获得。

10.权利要求9所述的固定化胰蛋白酶制剂的用途，其特征在于，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质，或用于胰岛素的生产。

11.一种用于酶解蛋白质或者变性蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求9所述的固定化胰蛋白酶制剂。