[发明专利]重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化

说明书

本发明涉及重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化。本发明对胰蛋白酶进行改造，在其羧基端引入Cys，获得稳定性以及固定化性能较优的胰蛋白酶，之后，利用优化的固定化方法，获得固定化的胰蛋白酶制剂，其不仅固定化效率高、稳定性好，且保留高的酶活性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化。

背景技术

蛋白酶作为高效的催化剂，被广泛运用于生物、化工等领域。然而生产实践中蛋白酶往往并不适于工业的生产，蛋白酶通常不稳定，而且多为水溶性，易被底物、产物和其他相关成分所抑制，同时工业生产条件较为苛刻，蛋白酶表现出稳定性范围是相对而言。因此提高蛋白酶的催化效率和稳定性是科研人员的重要研究方向。

非水相催化、蛋白酶的定向改造和固定化是提高蛋白酶的催化效率和稳定性的重要手段。蛋白酶固定化研究是较为直接、简单提升蛋白酶的稳定性、克服蛋白酶在反应体系中的稳定性的有效方式。适当的蛋白酶固定化，不仅起到增强蛋白酶稳定性的作用，同时也提高了蛋白酶重复利用效率，可提升蛋白酶的运用价值。

然而，蛋白酶作为一种具有生物活性的多肽，其固定化技术尚存在较多的问题，对于性质不同的酶，目前还无法以相同或相近的方法加以固定化。本发明人在研究过程中，发现常规的方式去对胰蛋白酶进行固定化，效果并不理想，一方面不易于高效地固定化，另一方面酶活性极易于发生改变甚至没有活性。

因此，需要针对胰蛋白酶这一具体的酶，探索不同的反应条件，找到适合于进行固定化的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供重组胰蛋白酶的改造及其定向固定化。

在本发明的第一方面，提供一种对胰蛋白酶进行固定化的方法，所述方法包括：

(1)在胰蛋白酶羧基端加上Cys(如1‐2个Cys)；

(2)将步骤(1)获得的胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂、三(2‐羧乙基)膦混合；

(3)以活化凝胶为固定化载体，将步骤(2)的混合液与之混合，进行固定化反应；

(4)将经固定化反应的产物在酸性条件下处理，解除胰蛋白酶抑制剂的抑制作用，获得固定化的活性胰蛋白酶。

在一个优选例中，步骤(2)中，胰蛋白酶与胰蛋白酶抑制剂的摩尔比为1:1‐10(较佳地1:1‐5；更佳地1:1‐4)，或质量比为1～5:1(较佳地(1.5～3)：1；更佳地2:1)。

在另一优选例中，胰蛋白酶与三(2‐羧乙基)膦的质量比为(5～50):1；较佳地(5～20):1。

在另一优选例中，步骤(2)中，所述的胰蛋白酶抑制剂为：抑肽酶，大豆胰蛋白酶抑制剂。

在另一优选例中，所述活化凝胶为活化的琼脂糖凝胶，更佳地如环氧活化或碘乙酸活化的琼脂糖凝胶。

在另一优选例中，固定化反应时，溶液的pH值为7.0至8.0，较佳地为7.5±0.2。

在另一优选例中，固定化反应时，温度为25～38℃；较佳地为25～35℃。

在另一优选例中，固定化反应时，反应时间为20～50小时；较佳地为25～40小时；更佳地为30～35小时。

在另一优选例中，所述到胰蛋白酶包括：胰蛋白酶变异体；较佳地，所述的变异体中，将其第99位Arg突变为His，并且在其羧基端加上Cys(如1‐2个Cys)。