[发明专利]一种亮氨酸氨肽酶3抑制剂的抑酶活性测定方法及应用在审
| 申请号： | 201810628630.1 | 申请日： | 2018-06-19 |
| 公开（公告）号： | CN108753914A | 公开（公告）日： | 2018-11-06 |
| 发明（设计）人： | 王学健;杨翰林;季胜萍;武慧娜;房春燕 | 申请（专利权）人： | 潍坊医学院 |
| 主分类号： | C12Q1/37 | 分类号： | C12Q1/37;C12Q1/02;C12N15/867 |
| 代理公司： | 济南圣达知识产权代理有限公司 37221 | 代理人： | 王志坤 |
| 地址： | 261053 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 亮氨酸氨肽酶 酶活性测定 活性抑制 试剂盒 酶源 人源 效果评价 细胞株 抑制剂 准确率 猪源 检测 应用 | ||
1.一种测定化合物亮氨酸氨肽酶3活性抑制率的方法，特征在于，以表达人源LAP3的K562-LAP3细胞株作为酶源进行化合物抑酶活性测定，步骤如下：
(1)将PBS清洗后的K562-LAP3细胞接种于96孔板中；
(2)向孔中加入不同浓度梯度的化合物；
(3)化合物作用一段时间后加入LAP3底物培养；
(4)测定405nm处的吸光度值，计算抑制率：
加药组平均OD值＝过表达加药组平均OD值-未过表达加药组平均OD值
不加药组平均OD值＝过表达组平均OD值-未过表达组平均OD值。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述K562-LAP3细胞接种于96孔板中的接种密度为1×105个/孔。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入化合物5min后加入LAP3底物至1.6mM，在37℃下培养30min。
4.权利要求1所述的K562-LAP3细胞株构建方法，步骤如下：
(1)加入完全培养液重悬K562细胞，接种于96孔板中培养；
(2)向孔中加入重组慢病毒LV-LAP3稀释液，并加入Polybrene作为病毒感染辅助剂，培养过夜；
(3)感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的K562细胞，从而获得稳定表达LAP3和嘌呤霉素抗性的K562-LAP3细胞株。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述K562细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，体积为80μL。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述重组慢病毒LV-LAP3稀释液的配置方法为：浓度为2×108TU/mL的重组慢病毒LV-LAP3原液，用ENi.S稀释，使MOI为40。
7.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中每孔加入所述重组慢病毒稀释液10μL，所述病毒感染辅助液Polybrene 10μL。
8.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)的具体操作为：感染三天后，加入嘌呤霉素筛选病毒感染的K562细胞，待对照组细胞全部死亡时换嘌呤霉素维持浓度为1.0mg/mL的培养液。
9.一种测定化合物抑制亮氨酸氨肽酶3活性的检测试剂盒，包括PBS溶液、96孔板、LAP3底物，其特征在于，还包含权利要求4-8所述方法构建的K562-LAP3细胞株。
10.权利要求1-3所述方法在LAP3抑制剂药物评价方面的应用。
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